Name: paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Мы благодарим профессора Eichele за предоставленную нам возможность использовать крио-микротоме. Работа была профинансирована Max-Planck-Gesselschaft.

1. Подготовка <ol><li> Недавно подготовить фиксатором Карнуа путем объединения абсолютного этанола, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношении 6:03:01 соответственно. 3 Это, а также все решения для погружения воротники следует хранить в стеклянных банках окрашивания (см. раздел реагентов для рекомендации). </li><li> Подготовка алюминиевой фольги карманы правильный размер для воротников. </li><li> Подготовьте следующие решения в окрашивании банки: 2 х 40% этанол, 70% этанола, 2 х 100% этанол, метилбензоата (МБ), 50/50 об. / МБ и парафина, 2 х парафин. Место МБ и парафина контейнеров в термостат до 60-65 ° С. </li><li> Теплый парафин вылить в фольгу карманы до 60-65 ° С. </li></ol> 2. Крепление Летает в воротничков <ol><li> Прикрепите воротник 4 под бинокулярным с помощью липкой ленты в вертикальном положении, где можно увидеть точки входа для летать. </li><li> Обезболить мухи использованием углекислого газа или с помощью гипотермии использованием ледяная глыба. Будьте осторожны, чтобы не заморозить мух. </li><li> Использование щипцов, подобрать индивидуальный мухи, захватывая их крыльев и поместить в воротник ориентированных правильно (головы и грудной клетки в верхней части лезвия и живота ниже лезвия). 10-20 мухи должны легко вписываться в воротник. </li></ol> Примечание: Если вы анализируете несколько генотипов, не забудьте сделать сведению воротник номер и соответствующий генотип. 3. Парафин Разделы дрозофилы Thoraxes <ol><li> Перемещение воротник к решению Карнуа и зафиксировать ткань при температуре 4 ° С в течение ночи. </li><li> После фиксации обезвоживают образца с помощью увеличения концентрации этанола. За 10 минут погрузиться воротник на 40% (2 раза), 70% и 100% (2 раза) этанола при комнатной температуре. Следующая воротник инкубировать в МБ и МБ + парафин решение (1:1) в течение 30 минут в каждой, а затем проникнуть воротник в две смены парафина в течение 60 минут каждый на 60-65 ° C. Быстро переместить воротник в фольгу карман и заполнить с топленым (60-65 ° С) парафин. Поместите его при комнатной температуре и позволяют парафином, чтобы стать жесткой (лучше всего оставить на ночь). Обратите внимание, что воротник можно поместить в карман в фольгу различной ориентации, в зависимости от ориентации разделы вам нужно (продольные или поперечные). </li><li> Берем сухой блоков парафина с воротниками из фольги и аккуратно отделить воротником из парафинового блока. С помощью острого лезвия или скальпеля аккуратно вырезать экстра-парафин со всего летать ткани. </li><li> Вырезать парафиновый блок с 7-10 мкм разделе шаги на вращение микротома и позволяют сократить ткани плавать квартиру в 37 ° С водяной бане. Место секционного ткани на полярных слайды и дать высохнуть в течение ночи. Эти слайды можно использовать для окрашивания hematoxyline и эозином (рис. 1А-D), толуидиновым синим, анилин синий или другой умирает для визуализации тканевых структур, а также для окрашивания антител (рис. 1E-E ``). </li></ol> 4. Cryosections дрозофилы Thoraxes <ol><li> Как и парафиновых срезов, подготовке летит в ворота и моды кармана алюминиевую фольгу. Замораживания кулер будет, необходимых для подготовки образцов. Убедитесь, что кулер составляет около -60 ° C, используйте немного этанола и сухой лед, чтобы для достижения этой температуры. Час, прежде чем начать эксперимент положил бутылку крио-вложение среды (ткани-Tek октября соединения) вниз головой в 4 ° C холодильник, чтобы охладить его и свести к минимуму образование воздушных пузырьков. </li><li> Перемещение воротник с летит в фольге карман, который был предварительно охладить в течение нескольких минут внутри замерзания охладителя и быстро заполнять крио-вложение соединения. Пусть образец заморозить в течение 3-10 мин. Аккуратно развернуть формируется блок внутри кулера, мягко отдельный воротник из вложения блок и поместить его при температуре -20 ° С в течение не менее одного дня. </li><li> Вырезать замороженных мышц на крио-микротома от -15 до -18 ° C с раздела толщиной 10-15 мкм. Место на поляризованных слайдов и сохранить при температуре -20 ° С до готовности делать дальнейшую обработку. Мы предлагаем крепления ткани в 4%-ный раствор формальдегида PBS в течение 10 мин при комнатной температуре до антитела окрашивания. </li></ol> 5. Липиды обнаружения в мышцах дрозофилы Липидные капли могут быть обнаружены с маслом красной O пятно на cryosections использованием протокола, принятого от Зибер и Thummel 5. <ol><li> После фиксации, мыть слайды с водой два раза в течение 5 мин, уравновешенную пропиленгликоля в течение 10 мин и инкубировать в течение 3 ч в масле красного пятна O при комнатной температуре. Затем промыть образцы 2 раза по 5 мин в пропиленгликоля и 30 мин в PBS. Горы в 30% глицерина. </li></ol> 6. Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Инжиррисунке 1. Парафиновыми-срезы Hematoxyline и эозином окрашенных поперечных (АВ) и продольного (CD) разделы косвенные мышцы полета. А и С показывает нормальную структурированную мышц. Аномальные по размеру и морфологии мышц представлены на B и D соответственно (черные стрелки). Поперечный разрез окрашенных грудной клетки дрозофилы с анти-LAMC, ядерной маркер конверт и DAPI, ядерной пятна (EF). Увеличенное изображение нормального (красная стрелка) и ухудшилось (желтая стрелка), мышц (F). G представляет раздел дрозофилы кишечного тракта с окрашенных LAMC и DAPI. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Замороженные срезы А. Поперечные закрепленные участки дрозофилы грудной клетки окрашиваются красным маслом O, этикетка липидные капли. Б. Продольное замороженных срезах косвенных летательные мышцы окрашиваются анти-Dg, мышечные сарколеммой маркер и DAPI.

<ol>
	<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> , (1950).</li><li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy.">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li><li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex.">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li><li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnoy+fixation:+practical+and+theoretical+considerations.">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila - A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila.">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stainless steel collars</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Specially constructed</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools GmbH</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blade or scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wheaton macro staining jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton Science Products </td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model: Hyrax M25</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryo-microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model CM3050S</td>
</tr>
<tr>
<td>60-65&deg;C Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Large enough to hold at least 4 staining jars</td>
</tr>
<tr>
<td>Freezing cooler with metal block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Store at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Super-frost slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>9161155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Recommend 24 X 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>288306</td>
<td>Analytical grade </td>
</tr>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100063</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylbenzoate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M29908-500G</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>76258</td>
<td>Paraffin</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Teck O.C.T. compound</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura</td>
<td>4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16% formaldehyde, methanol free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>18814</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G5150-1L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles

Молекулярная характеристика мышечной дистрофии и миопатии у людей выявил сложность заболевания мышц и генетический анализ мышечной спецификации, формирование и функции в модельных системах предоставил ценную информацию в мышечную физиологию. Таким образом, выявление и характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе повреждения мышц имеет решающее значение. Структура взрослых дрозофил мульти-волокна мышц напоминают позвоночных поперечно-полосатых мышц 1 и генетических уступчивость дрозофилы сделала большой системы для анализа морфологии дистрофические мышц и охарактеризовать процессы, затрагивающие мышечной функции в процессе старения взрослых мух 2. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Эти препараты позволяют ткани, которая будет окрашивали классических гистологических пятен и помечены с белком обнаружения красителей, и, в частности cryosections идеально подходят для иммуногистохимического выявления белка в интактных мышцах. Это позволяет для анализа структуры мышечной ткани, определение морфологических дефектов, и обнаружение экспрессии для мышечной / нейрон-специфических белков в мышцах дрозофилы взрослых. Эти методы также могут быть слегка модифицирован для секционирования других частей тела.

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Определение механизмов, лежащих повреждение мышц имеет решающее значение. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Это позволяет анализировать морфологию мышц и локализация белка и других компонентов клетки мышц.

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Всего записей сотовый от мозга взрослого дрозофилы

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Подготовка Разработка и взрослых Drosophila Мозги и сетчатки для живых изображений

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Препарирование Oenocytes от взрослых Дрозофилы</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Подготовка взрослых Drosophila Глаза для тонких Секционирование и микроскопический анализ

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Непрямой иммунофлюоресценции на замороженные Разделы молочной железы мыши

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...