Name: paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Vi tackar Prof. Eichele för att tillåta oss att använda Cryo-mikrotomen. Arbetet har finansierats av Max-Planck-Gesselschaft.

1. Förberedelser <ol><li> Färskt förbereda Carnoy är fixativ genom att kombinera absolut etanol, kloroform och isättika i proportion 06:03:01 respektive. 3 Detta, liksom alla lösningar för att sänka ned halsband bör förvaras i glasburkar färgning (se reagenser avsnitt för rekommendation). </li><li> Förbered aluminiumfolie fickor rätt storlek för kragar. </li><li> Förbered följande lösningar i färgning burkar: 2 x 40% etanol, 70% etanol, 2 x 100% etanol, metylbensoat (MB), 50/50 v / v MB och paraffin, 2 X paraffin. Placera MB och behållare paraffin i en inkubator inställd på 60-65 ° C. </li><li> Varmt paraffin att hälla i folie fickor 60-65 ° C. </li></ol> 2. Fastställande Flugor i Halsband <ol><li> Fäst kragen 4 under kikare med tejp i en vertikal position där du kan se ingångspunkt för flugan. </li><li> Bedöva flyger med hjälp av koldioxid eller via hypotermi med ett isblock. Var noga med att inte frysa flugor. </li><li> Använd pincett, plocka upp enskilda flugor genom att ta tag sina vingar och placera in i kragen orienterade ordentligt (huvud och bröstkorg på toppen av bladen och buken nedanför bladen). 10-20 flugor bör lätt passa in i kragen. </li></ol> Obs: Om du analyserar flera genotyper, glöm inte att anteckna kragen numret och motsvarande genotyp. 3. Paraffin av Drosophila Thoraxes <ol><li> Flytta kragen till Carnoy lösning och fixa vävnaden vid 4 ° C över natten. </li><li> Efter fixering, torkar provet med ökande koncentrationer av etanol. För 10 minuter varje dränka kragen till 40% (2 gånger), 70% och 100% (2 gånger) etanol vid rumstemperatur. Nästa inkubera krage i MB och MB + paraffin-lösning (1:1) i 30 min i varje och sedan infiltrera kragen i två förändringar av paraffin i 60 min vardera vid 60-65 ° C. Snabbt flytta kragen in i folie fickan och fyll med smält (60-65 ° C) paraffin. Placera den i rumstemperatur och låt paraffin bli hårt (det är bäst att lämna över natten). Notera att kragen kan placeras i folien fickan i olika inriktningar, beroende på inriktningen på de avsnitt du behöver (längsgående eller tvärgående). </li><li> Packa torrt paraffinblock med kragar från folien och försiktigt separera kragen från paraffin blocket. Med hjälp av en vass kniv eller skalpell Skär försiktigt ut den extra-paraffin från hela flugan vävnad. </li><li> Skär paraffin block med 7-10 steg ìm avsnitt på ett rotationsschema mikrotomen och låta skära vävnaden flyta lägenhet i ett 37 ° C vattenbad. Placera delad vävnad polära diabilder och låt torka över natten. Dessa bilder kan användas för färgning med hematoxyline och eosin (Figur 1A-D), toluidinblått, anilin blå eller annan dör för att visualisera vävnader, samt för antikroppar färgning (Figur 1E-E ``). </li></ol> 4. Kryosnitt av Drosophila Thoraxes <ol><li> Som med paraffin, förbereda flugor i en krage och mode en aluminiumfolie ficka. En frysning kylare kommer att behövas för att förbereda prover. Se till att kylaren är runt -60 ° C, använd lite etanol och torris för att för att nå denna temperatur. En timme innan försöket satte flaskan med Cryo-inbäddning medium (Tissue-Tek oktober förening) upp och ner i en 4 ° C kylskåp för att kyla ner det och för att minimera bildandet av luftbubblor. </li><li> Flytta krage med flyger till folien fickan som har nedkylda i flera minuter inne i frysning svalare och snabbt fylla med Cryo-inbäddning förening. Låt provet frysa i 3-10 min. Försiktigt packa upp bildade blocket inne i svalare, försiktigt separera kragen från inbäddning blocket och satte den vid -20 ° C under minst en dag. </li><li> Skär den frusna musklerna på ett Cryo-mikrotom mellan -15 och -18 ° C med ett avsnitt tjocklek på 10-15 ìm. Placera på polariserade diabilder och hålla vid -20 ° C tills den ska göra vidare bearbetning. Vi föreslår fastställande av vävnad i 4% formaldehyd PBS-lösning för 10 minuter i rumstemperatur före antikroppar färgning. </li></ol> 5. Lipider Påvisande i Drosophila Muskler Lipiddropparna kan upptäckas med olja röda O fläck på kryosnitt hjälp av ett protokoll som antogs av Sieber och Thummel 5. <ol><li> Efter fixering, tvätta objektglasen med vatten två gånger i 5 minuter till jämvikt i propylenglykol i 10 min och inkubera i 3 timmar i olja rött O fläck vid rumstemperatur. Tvätta sedan prover 2 ggr i 5 min i propylenglykol och 30 minuter i PBS. Montera i 30% glycerol. </li></ol> 6. Representativa resultat: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figure 1. Parrafin-inbäddade profiler Hematoxyline och eosine färgade tvärgående (AB) och longitudinella (CD) avsnitt av indirekta flyg muskler. A och C visar normal strukturerad muskler. Onormal efter storlek och morfologi muskler är representerade på B respektive D. (svarta pilar). Tvärsnitt af Drosophila bröstkorgen färgade med anti-LamC, kärnhöljet markör och DAPI, kärn-bets (EF). Förstorad bild av normal (röd pil) och försämrades (gul pil) muskler (F). G står för del av Drosophila tarmkanalen färgas med LamC och DAPI. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Frysta snitt A. Tvärgående frysta snitt av Drosophila bröstkorgen målat med olja röd O, lipiddropparna etikett. B. Längsgående frysta snitt av indirekta flygmuskler färgade med anti-Dg, muskel sarcolemma markör och DAPI.

<ol>
	<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> , (1950).</li><li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy.">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li><li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex.">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li><li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnoy+fixation:+practical+and+theoretical+considerations.">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila - A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila.">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stainless steel collars</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Specially constructed</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools GmbH</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blade or scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wheaton macro staining jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton Science Products </td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model: Hyrax M25</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryo-microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model CM3050S</td>
</tr>
<tr>
<td>60-65&deg;C Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Large enough to hold at least 4 staining jars</td>
</tr>
<tr>
<td>Freezing cooler with metal block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Store at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Super-frost slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>9161155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Recommend 24 X 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>288306</td>
<td>Analytical grade </td>
</tr>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100063</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylbenzoate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M29908-500G</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>76258</td>
<td>Paraffin</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Teck O.C.T. compound</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura</td>
<td>4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16% formaldehyde, methanol free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>18814</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G5150-1L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles

Den molekylära karakterisering av muskeldystrofi och myopatier på människa har visat komplexitet muskelsjukdom och genetisk analys av muskel specifikation, har bildning och funktion i modellsystem gett värdefulla insikter i muskelfysiologi. Därför identifiera och karakterisera molekylära mekanismer som ligger bakom muskelskada är kritisk. Strukturen för vuxna Drosophila flera fibrer muskler likna ryggradsdjur tvärstrimmiga musklerna 1 och den genetiska spårbarhet Drosophila har gjort det ett bra system för att analysera dystrofa muskler morfologi och beskriva de processer som påverkar muskelfunktion i åldrande vuxna flugor 2. Här presenterar vi de histologiska teknik för att förbereda paraffininbäddade och frysta delar av Drosophila bröstkorg muskler. Dessa förberedelser möjliggöra vävnad färgas med klassiska histologiska fläckar och märkta med protein upptäcka färgämnen, och särskilt kryosnitt är idealiska för immunhistokemisk detektion av proteiner i intakta muskler. Detta gör det möjligt för analys av muskelvävnad struktur, identifiering av morfologiska defekter, och detektion av uttrycket mönstret för muskel / neuron-specifika proteiner i Drosophila vuxna muskler. Dessa tekniker kan också vara något modifierad för sektionering av andra kroppsdelar.

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identifiering av mekanismerna bakom muskelskador är avgörande. Här presenterar vi de histologiska teknik för att förbereda paraffininbäddade och frysta delar av Drosophila bröstkorg muskler. Detta möjliggör analys av muskel morfologi och lokalisering av protein och andra muskel-komponenter cell.

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Helcells Inspelningar från hjärnan hos vuxna Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Högupplöst video Spårning av rörelseorgan hos vuxna Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Beredning av Utveckla och vuxna Drosophila Brains och retinae för Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissekering av Oenocytes från Vuxen Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Beredning av vuxna Drosophila Ögon för Thin Sektionering och mikroskopisk analys

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomic Provberedning från formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR är en känslig och snabb metod för detektion av Cytomegaloviral DNA i formalinfixerade, paraffininbäddade Biopsi Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirekt immunofluorescens på frysta sektioner av Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anställa Digital Droppe PCR för att upptäcka BRAF V600E Mutationer i formalinfixerade paraffininbäddade referensstandard cellinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...