Name: paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Biz bize cryo-mikrotom kullanmak için izin verdiği için Prof. Eichele teşekkür ederim. İş Max-Planck-Gesselschaft tarafından finanse edildi.

1. Hazırlık <ol><li> Taze 3 Bu oran 06:03:01 sırasıyla mutlak etanol, kloroform ve buzul asetik asit birleştirerek Carnoy Kullanıcı fiksatif hazırlamak yanı sıra daldırarak yaka için tüm çözümleri (öneri için reaktifler bölümüne bakınız) cam boyama kavanoz içinde muhafaza edilmelidir. </li><li> Alüminyum folyo hazırlayın yaka için doğru boyutu cebe. </li><li> 2 X% 40 etanol,% 70 etanol, 2 X% 100 etanol, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v MB ve parafin, 2 X parafin: kavanoz boyama aşağıdaki çözümleri hazırlayın. 60-65 ° C için bir kuluçka set MB ve parafin kapları koyun. </li><li> 60-65 ° C folyo ceplerine dökmek Sıcak parafin </li></ol> 2. Sinekler yaka içinde Tespit <ol><li> Binoküler altında dikey konumda sinek için giriş noktası görebileceğiniz bir bant kullanarak yaka 4 takın. </li><li> Anestezisi bir buz bloğu kullanarak karbon dioksit veya hipotermi ile uçar. Sineklerin dondurmak için dikkatli olun. </li><li> Forseps kullanarak, doğru yönde (bıçakları ve bıçaklar altında karnın üst baş ve göğüs) yaka içine kanatları ve yer kapma bireysel sinekler pick up. 10-20 sinekler yaka kolayca sığacak gerekir. </li></ol> Not: Birden fazla genotipleri analiz yapıyorsanız, yaka numarasını ve ilgili genotip bir yere not etmeyi unutmayın. 3. Drosophila Thoraxes Parafin Bölüm <ol><li> Carnoy çözümü için yaka yerini değiştirin ve doku düzeltmek 4 ° C, gece boyunca. </li><li> Fiksasyon sonra, etanol artan konsantrasyonlarda kullanarak örnek kurutmak. 10 dakika her biri% 40 (2 kez),% 70 ve% 100 oda sıcaklığında (2 kez) etanol içine daldırın yaka için. Sonraki inkübe MB ve MB + parafin çözüm (1:1) yaka ve her 30 dakika için 60-65, her biri için 60 dk iki değişiklik parafin ° C yaka sızmak Hızla folyo cebine yaka taşınmaya ve erimiş (60-65 ° C) parafin ile doldurun. Oda sıcaklığında yerleştirin ve parafin (o gecede terk etmek en iyisidir) sabit hale izin. Yaka (boyuna veya enine) bölümleri yönünü bağlı olarak, farklı yönelimleri folyo cebe yerleştirilir olduğunu unutmayın. </li><li> Folyo yaka kuru parafin blokları Unwrap ve parafin blok hafifçe yaka ayrı. Sinek doku etrafında ekstra parafin, keskin bir bıçak ya da neşter yardımıyla dikkatlice kesip. </li><li> Kes bir dönme mikrotom 7-10 mikron bölüm adımlarla parafin blok ve 37 ° C su banyosunda kesilen doku düz float izin. Kutup slaytlar kesitli doku yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin. Bu slaytlar Hematoksilen ve eozin ile boyanması için kullanılabilir (Şekil 1A-B), toluidin mavi, anilin mavisi veya diğer ölür doku yapıları görselleştirmek için, hem antikor boyama gibi (Şekil 1E-E ``). </li></ol> 4. Drosophila Thoraxes, Cryosections <ol><li> Parafin bölümlerde olduğu gibi, bir yaka ve moda bir alüminyum folyo cep sinek hazırlamak. Dondurma soğutucusu örnekleri hazırlamak için gerekli olacaktır. Soğutucu -60 civarında olduğundan emin olun ° C, bu sıcaklık ulaşmak için izin vermek için küçük bir etanol ve kuru buz kullanın. Deney başlamadan önce bir saat soğumasını ve hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirmek için 4 ° C buzdolabı ters cryo gömme orta şişe (Doku Tek Ekim bileşik) koymak. </li><li> Dondurucu soğutucu içinde birkaç dakika için ön soğutmalı ve hızla cryo gömme bileşik ile doldurun olmuştur folyo cebe sinekler yaka yerini değiştirin. 3-10 dakika için örnek donmasına izin. Dikkatle, soğutucu içinde oluşan blok unwrap yavaşça gömme blok yaka ayrı ve en az bir gün için -20 ° C&#39;de koydu. </li><li> -15 Ve -18 ° C arasında bir mikrotom cryo bir bölümü 10-15 mikron kalınlığında donmuş kasları kesin. Polarize slaytlar yerleştirin ve daha fazla işlem yapmak için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de tutmak. Antikor boyama önce oda sıcaklığında 10 dakika için% 4 formaldehit PBS çözüm doku sabitleme öneririz. </li></ol> 5. Drosophila Kaslar Lipidler Algılama Lipid damlacıkları yağı kırmızı O Sieber ve Thummel 5 kabul edilen bir protokol kullanarak cryosections leke ile tespit edilebilir . <ol><li> Fiksasyon sonra, 5 dk, 10 dk inkübe 3 yağ kırmızı O saat oda sıcaklığında leke için propilen glikol dengelenmiş slaytlar için iki kez su ile yıkayın. Ardından, propilen glikol ve PBS içinde 30 dakika 5 dakika örnekleri 2 kez yıkayın. % 30 gliserol Dağı. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Incirure 1. Parrafin-gömülü bölümleri Dolaylı uçuş kaslarına Hematoksilen ve eozin boyanmış enine (AB) ve boyuna (CD) bölümleri. A ve C normal yapılandırılmış kasları gösterir. Anormal boyutu ve morfolojisi kasları sırasıyla B ve D (siyah ok) temsil edilmektedir. Anti-LamC leke nükleer (EF), çekirdek zarı marker ve DAPI, Drosophila toraks boyanmış enine bölümü. Normal büyütülmüş görünümü (kırmızı ok) ve bozulmuş (sarı ok) kasları (F). G LamC ve DAPI Drosophila bağırsak boyanan bölümünde temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Frozen Drosophila toraks yağı kırmızı O, lipid damlacıkları etiket ile boyanmış A. Transvers frozen. B. dolaylı uçuş kaslarına Boyuna frozen anti-Dg, kas sarcolemma işaretleyici ve DAPI ile boyandı.

<ol>
	<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> , (1950).</li><li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy.">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li><li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex.">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li><li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnoy+fixation:+practical+and+theoretical+considerations.">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila - A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila.">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stainless steel collars</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Specially constructed</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools GmbH</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blade or scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wheaton macro staining jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton Science Products </td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model: Hyrax M25</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryo-microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model CM3050S</td>
</tr>
<tr>
<td>60-65&deg;C Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Large enough to hold at least 4 staining jars</td>
</tr>
<tr>
<td>Freezing cooler with metal block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Store at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Super-frost slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>9161155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Recommend 24 X 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>288306</td>
<td>Analytical grade </td>
</tr>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100063</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylbenzoate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M29908-500G</td>
<td>Analytical grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>76258</td>
<td>Paraffin</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Teck O.C.T. compound</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura</td>
<td>4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16% formaldehyde, methanol free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>18814</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G5150-1L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paraffin-embedded and frozen sections of drosophila adult muscles

Insanlarda kas distrofiler ve miyopatiler moleküler karakterizasyonu, kas hastalığı ve kas belirtimi genetik analiz karmaşıklığını ortaya koymuştur model sistemler oluşumu ve işlevi kas fizyolojisi değerli bilgiler sağladı. Bu nedenle, kas hasarı altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize belirlenmesi ve kritik öneme sahiptir. Yetişkin Drosophila çok lifli kas yapısı, omurgalı çizgili kaslar 1 ve Drosophila, genetik tractability distrofik kas morfolojisi analiz ve yaşlanma yetişkin kas fonksiyonunu etkileyen süreçler 2 uçar karakterize etmek için büyük bir sistem yaptı benzerler . Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu hazırlıklar, klasik histolojik lekeleri ile protein tespit boya ile boyanmış ve etiketlenmesine doku için izin ve özellikle cryosections sağlam kaslarda protein immünohistokimyasal tespiti için idealdir. Bu kas dokusunun yapısı, morfolojik kusurların belirlenmesi, ve kas / Drosophila yetişkin kaslarda nöron-spesifik proteinlerin ifade deseninin tespit analizi sağlar. Bu teknikler, aynı zamanda diğer vücut parçaları kesit için biraz değiştirilmiş olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles at JoVE.com

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Kas hasarı altta yatan mekanizmaların belirlenmesi çok önemlidir. Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu kas morfoloji ve protein ve diğer kas hücre bileşenleri lokalizasyonu analizi sağlar.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...