Name: protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti (RO1 AI68002).

1. Ricombinante SARS-CoV RBD proteine ​​preparazione <ol><li> Preparare fosfato di calcio dei reagenti di trasfezione <ol><li> 2X preparazione tampone HBS: Mescolare 16 g di NaCl, 0,4 g di Na 2 HPO 4 * 7H 2 O e 13,0 g di HEPES. Regolare il pH a 7,00 e portare il volume totale di 1000 ml di acqua distillata. Dopo il filtraggio la soluzione per la sterilizzazione, aliquota e conservarlo a -20 ° C. Suggerimento: Ogni variazione del valore di pH potrebbe influenzare i risultati di trasfezione. Quindi, si consiglia di testare diversi valori di pH intorno a 7,00 (per esempio, 6,99, 7,00 o 7,01) e trovare la migliore per la trasfezione con il metodo introdotto di seguito. </li><li> 2,5 M CaCl 2 Preparazione: Aggiungere 73,5 g di CaCl 2 * 2H 2 O in acqua distillata in un volume finale di 200 mL. Filtrare la soluzione e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Trasfezione plasmide ricombinante e purificazione di proteine <ol><li> Dividere le celle 293T al 50-70% confluenza 24 ore prima di trasfezione. Crescere le cellule di T-175 palloni tessuto cm 2 cultura in 40 ml di DMEM contenente 10% di siero (HI) FBS e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Tutti i reagenti di trasfezione deve essere portato a temperatura ambiente prima di trasfezione. Questi reagenti sono HBS 2X, 2.5M CaCl 2, DIH 2 O, e rRBD plasmide 6. Suggerimento: Il plasmide ricombinante finale costrutto usato per l&#39;espressione delle proteine ​​dovrebbe contenere un peptide segnale per garantire la secrezione di proteine ​​ricombinanti espresse al supernatante della coltura. Un 6x suoi tag possono essere aggiunti al C-terminale della proteina espressa per la purificazione facile. </li><li> Preparare un 50 ml (A) e uno da 15 ml (B) BD tubo Falcon, e aggiungere i reagenti per i tubi, come indicato nella tabella 1. Aggiungi 2X tampone HBS ad A. Tubo in tubo B, aggiungere 2,5 M CaCl 2 e rRBD plasmide, e portare il volume al requisito in DIH 2 O. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. Un T-175 cm 2 cultura fiasco tessuti (4000 microlitri / cilindro): prepararsi per l&#39;espressione rRBD </td></tr><tr><td colspan="2"> Un tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> HBS 2X </td><td> 2000 microlitri </td><td> 2,5 M CaCl 2 </td><td> 200 l </td></tr><tr><td></td><td></td><td> rRBD DNA plasmidico </td><td> 40 mcg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DIH 2 O a </td><td> 2000 microlitri </td></tr><tr><td colspan="4"> B. One 100 mm scatola di Petri (1000 ml / piatto): prepararsi per la produzione di pseudovirus SARS </td></tr><tr><td colspan="2"> Un tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> HBS 2X </td><td> 500 microlitri </td><td> 2,5 M CaCl 2 </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmidico SARS-CoV S </td><td> 5 mcg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> HIV-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 mcg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DIH 2 O a </td><td> 500 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Miscela di preparazione Transfection e volumi I volumi elencati nella Tabella 1 sono per una unità di trasfezione. Se più fiaschi o piatti vengono utilizzati per la transfezione, regolare i volumi di conseguenza. </li><li> Aggiungere il DNA di calcio soluzione in B tubo nel tubo A in maniera goccia a goccia, pur mantenendo costante e dolce mescolando in un vortice. Lasciate il composto a temperatura ambiente per 20-30 min. La chiave per il successo di trasfezione fosfato di calcio dipende dalle dimensioni e la forma del precipitato formato. Così, la miscela deve essere costantemente in agitazione e lentamente per soddisfare questo requisito e, di conseguenza, migliorare l&#39;efficacia di trasfezione. </li><li> Aggiungete il composto in maniera goccia a goccia e anche in cellule 293T (4000 microlitri / fiasco). Cellule cultura in incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Sostituire il terreno di coltura fresca senza siero OPTI-MEM ho ridotto-siero Media (50 mL / beuta) 8-10 ore dopo la trasfezione. Continuare a celle di coltura per due giorni nelle stesse condizioni. </li><li> Raccogliere il supernatante contenente proteine ​​espresse rRBD 72 h post-trasfezione. Centrifugare a 6000 rpm per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Aggiungi cocktail inibitore della proteasi per il supernatante raccolto e conservare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno dopo, purificare rRBD proteina ricombinante dal supernatante della coltura utilizzando le istruzioni Ni-NTA produttore Superflow successivo. </li><li> Concentrato di proteine ​​purificate utilizzando Amicon Ultra tubi concentrazione -15. Dopo la concentrazione di proteine,aggiungere PBS ai tubi concentrazione e centrifugare di nuovo per rimuovere imidazolo in tampone di eluizione. Calcolare la concentrazione di proteine ​​e conservare le proteine ​​purificate a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Immunizzazione del mouse e Prelievo dei campioni <ol><li> Preriscaldare Sigma sistema adiuvante (SAS) a 40-45 ° C secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 1 ml di PBS per flacone e mescolare accuratamente. </li><li> Preparare proteina-adiuvante emulsione secondo il protocollo nella tabella 2. Pipetta calcolato proteina rRBD in un tubo di 1,5 ml. Aggiungere uguale volume di SAS adiuvante per il tubo e agitare vigorosamente per 2-3 minuti per formare emulsione. Suggerimento: I volumi elencati nella tabella 2 sono per un mouse. Regolare i volumi secondo i numeri del mouse effettivamente utilizzato. Per ogni gruppo, si mescolano le proteine ​​e adiuvante necessari per ogni vaccino. Sempre preparare un campione in più per la vaccinazione per garantire l&#39;accuratezza. <table border="1"><tbody><tr><td> Gruppo </td><td> 1 ° vaccino (200 l / mouse) </td><td> 2 ° vaccino (200 l / mouse) </td><td> 3 ° vaccino (200 l / mouse) </td></tr><tr><td> rRBD proteina </td><td> 20 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS </td><td> 10 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS </td><td> 10 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS </td></tr><tr><td> PBS controllo </td><td> 100 ul PBS + 100 ul SAS </td><td> 100 ul PBS + 100 ul SAS </td><td> 100 ul PBS + 100 ul SAS </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Mouse immunizzazione protocollo </li><li> Per via sottocutanea in prima serata immunizzare femminile topi BALB / c (4-6 settimane, 5 topi / gruppo), e aumentare due volte con rRBD e SAS, come indicato nella tabella 2. Usa PBS gruppo come il controllo. Il sito per iniezioni sottocutanee di solito scelto è la pelle flaccida tra le scapole. In alternativa, l&#39;addome ventrale è comunemente usato, perché è più facile da iniettare, e può osservare eventuali perdite dai siti di iniezione. Quando dosi ripetute di vaccini vengono utilizzati, è facile selezionare i siti di iniezione diversi, evitando potenziali reazioni cutanee locali. </li><li> Bleed topi via retro-orbitale con anestetico prima vaccinazione e 10 giorni dopo ogni vaccinazione, e il calore siero a 56 ° C per 30 minuti per inattivare il complemento. Conservare il mouse siero a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Neutralizzazione di rilevamento utilizzando neutralizzazione saggio Pseudovirus <ol><li> Preparare pseudovirus SARS <ol><li> Dividere le celle 293T in 100 piatti della cultura millimetro di tessuto di Petri (2x10 6 cellule / piatto) 16 h prima di trasfezione, le cellule e far crescere come sopra. </li><li> Preparare i reagenti di trasfezione, come indicato nella tabella 1. Proteine ​​co-trasfezione una codifica plasmide SARS-CoV S e una codifica plasmide Env-difettoso, luciferasi che esprimono genoma dell&#39;HIV-1 (pNL4-3.luc.RE) con fosfato di calcio dei reagenti di trasfezione. </li><li> Sostituire media con 10 ml fresca DMEM contenente 10% FBS e 1% P / S 8-10 ore dopo la trasfezione. Raccogliere il supernatante contenente pseudovirus SARS 72 h post-trasfezione. </li><li> Pseudovirus filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> SARS pseudovirus test di neutralizzazione <ol><li> Dividere le celle 293T esprimono SARS-CoV recettore ACE2 (ACE2/293T) a 10 4 cells/100 microlitri / pozzetto in piastre da 96 pozzetti tessuto cultura 16 h prima dell&#39;infezione. </li><li> Diluire pseudovirus SARS da 2 volte a rilevare il titolo del virus nelle cellule ACE2/293T. </li><li> Serialmente diluire i sieri del mouse in lastre di tessuto da 96 pozzetti cultura, e aggiungere uguale volume di titolato pseudovirus SARS. Preincubare le piastre a 37 ° C per 1 h. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 100 microlitri della Sera-pseudovirus miscela di cellule ACE2/293T, e continuano a crescere le cellule a 37 ° C in 5% di CO 2. Aggiungi fresca DMEM 24 ore più tardi. </li><li> Rimuovere completamente sovranatanti dalle piastre 72 ore dopo l&#39;infezione. Aggiungi 1X luciferasi cultura reagente di lisi cellulare (60 microlitri / pozzetto), e promuovere la lisi cellulare con costante agitazione di piastre per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Trasferimento lisati cellulari (50 ml / pozzetto) in piastre luminometro (Microfluor piastre a 96 pozzetti). Aggiungere substrato luciferasi (50 ml / pozzetto) inclusi nel sistema di analisi luciferasi, e di rilevare l&#39;attività relativa luciferasi in Ultra 384 luminometro. </li><li> Calcolare titolo pseudovirus SARS neutralizzazione e presente come il 50% titolo di anticorpi neutralizzanti (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens.">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li><li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theileria+annulata:+control+measures,+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines.">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li><li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mouse,+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1+rV270.">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells.">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li><li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian,+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity.">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li><li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor.">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li><li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus.">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li><li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies:+implication+for+developing+subunit+vaccine.">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li><li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection.">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li><li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents.">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca(2+)-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis.">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li><li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein.">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Densità delle cellule è un fattore importante per l&#39;efficacia di fosfato di calcio a base di trasfezione. Nella nostra esperienza, meno del 70% confluenza delle cellule porta i migliori risultati. Pertanto, al fine di migliorare l&#39;efficienza di trasfezione, si raccomanda che la densità delle cellule mantenuto a circa 50-70% di confluenza. Il fosfato di calcio metodo di trasfezione è generalmente ritenuto meno efficiente rispetto ai metodi di transfezione altri, come la transfezione lipidi 16. Tuttavia, in questo protocollo, abbiamo usato una versione modificata del metodo di fosfato di calcio trasfezione cui costante e lenta miscelazione della soluzione di trasfezione in un vortice assicura la formazione di un precipitato con la dimensione appropriata e la forma, migliorando così l&#39;efficienza di trasfezione.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4*7H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2*2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C5080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HI FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10438</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OPTI-MEM I Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11836170001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Superflow</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>30450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigma adjuvant system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase assay system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase cell culture lysis reagent (5X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra - 15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC901024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfluor 96-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra 384 luminometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection

Sulla base del loro profilo di sicurezza e la capacità di indurre potenti risposte immunitarie contro le infezioni, vaccini a subunità sono stati usati come candidati per una vasta gamma di agenti patogeni 1-3. Dato che il sistema delle cellule di mammifero è in grado di modificazioni post-traduzionali, in modo da formare le proteine ​​accuratamente piegati e glicosilata, proteine ​​ricombinanti espresse in cellule di mammifero hanno dimostrato il potenziale maggiore per mantenere alta l&#39;antigenicità e immunogenicità 4-6. Sebbene non nuovi casi di SARS sono stati segnalati dal 2004, future epidemie sono una minaccia costante, quindi, lo sviluppo di vaccini contro la SARS-CoV è un passo prudente preventiva e deve essere effettuata. L&#39;RBD di proteine ​​SARS-CoV S svolge un ruolo importante nel legame recettore e induzione di specifici anticorpi neutralizzanti contro l&#39;infezione da virus 7-9. Pertanto, in questo protocollo, si descrivono nuovi metodi per lo sviluppo di un vaccino basato RBD subunità contro la SARS. In breve, la proteina ricombinante RBD (rRBD) è stato espresso in supernatante della coltura di cellule di mammifero 293T per ottenere una proteina correttamente ripiegata con conformazione corretta e l&#39;immunogenicità di alta 6. La transfezione della codifica RBD plasmide ricombinante per le cellule è stata poi effettuata utilizzando un metodo di fosfato di calcio trasfezione 6,10 con alcune modifiche. Rispetto al metodo di trasfezione lipidi 11,12, questo metodo modificato fosfato di calcio transfezione è più conveniente, più facile da gestire, e ha il potenziale per raggiungere elevata efficacia una volta un complesso di transfezione con dimensioni adatte e la forma è formata 13,14. Infine, un saggio di neutralizzazione pseudovirus SARS è stato introdotto nel protocollo e utilizzati per rilevare l&#39;attività neutralizzante di sieri di topi vaccinati con proteine ​​rRBD. Questo test è relativamente sicuro, non comporta alcuna infettive SARS-CoV, e può essere eseguito senza la necessità di un laboratorio di biosicurezza-3 15. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato anche per la progettazione e lo studio vaccini a subunità ricombinanti contro altri virus con classe I proteine ​​di fusione, per esempio, l&#39;HIV, il virus respiratorio sinciziale (RSV), virus Ebola, virus dell&#39;influenza, così come virus Nipah e Handra. Inoltre, i metodi per generare un pseudovirus e, successivamente, che istituisce un saggio di neutralizzazione pseudovirus può essere applicato a tutti questi virus.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection at JoVE.com

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Questo protocollo descrive una procedura generale per lo studio ricombinante del recettore dominio di legame (RBD) a base di vaccini a subunità contro la SARS. Esso include metodi per la trasfezione ed espressione di proteine ​​nelle cellule 293T RBD, l&#39;immunizzazione di topi con RBD e la rilevazione di attività di neutralizzazione del mouse utilizzando un siero stabilito pseudovirus SARS saggio di neutralizzazione.

Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Analisi degli analoghi dell'acido iofenostico nella piccola mangusta indiana (Herpestes Auropunctatus) Sera per l'uso come marcatore biologico di vaccinazione della rabbia orale

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...