Name: rna interference in ticks
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Ticks at JoVE.com

אנו מודים לחברי במעבדות שלנו לדיונים פוריים וסיוע טכני. מצגת זו וידאו נתמך על ידי דיקן שותף למחקר מחלקת Pathobiology וטרינרית, מרכז וטרינרי למדעי הבריאות, אוקלהומה סטייט. המחקר מומן על ידי דה Ministerio Ciencia דואר Innovación, ספרד (הפרויקט BFU2008-01244/BMC), פרויקט CSIC עירונית PA1002451 כדי JF, נתרמו ר וולטר Sitlington הקתדרה לחקר בעלי חיים מזון כדי KMK, CVHS 2009 RAC מענק, OAES לבריאות בעלי חיים קרנות USDA, המענק הלאומי לחקר יוזמת תחרותי, מס &#39;2007-04613.

1. דור dsRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז פריימרים oligonucleotide המכיל רצפים T7 האמרגן עבור ב שעתוק במבחנה סינתזה של dsRNA (לדוגמה, עבור Dermacentor variabilis subolesin להשתמש primers oligonucleotide D8AAT75: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 &#39;ו D8DVT73: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3 &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amplify גן היעד על ידי RT-PCR באמצעות 10 pmol של פריימר כל oligonucleotide ו 1-10 ננוגרם של רנ&quot;א סך לתקתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצר ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז dsRNA באמצעות 8 μL של המוצר מטוהרים PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת dsRNA ידי ספקטרומטריית. </li></ol> 2. הזרקה של קרציות עם dsRNA. 2.1. הכנת קרציות להזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לשטוף את קרציות בסדרה של פתרונות על ידי רועדת להם פתרון כל שפופרת 50 מ&quot;ל צנטריפוגה חד פעמיות, decanting הפתרון באמצעות מסך חוט דק רשת מעל הצינור כדי לשמור על קרציות. רצף של פתרונות קרציות הכביסה מי ברז, מי חמצן 3%, שני שוטפת של מים מזוקקים, אתנול 70% ושני שוטף יותר עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם יבש קרציות על מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן קרציות לקבוצות של 20 עד 50, תלוי בניסוי, המקום קרציות מקבוצה כל כוס פלסטיק 1.25 גרם עם מכסה מתאים בחוזקה תווית עם מספר קבוצת הניסוי. </li></ol> 2.2. סמן צוות ההזרקה. צוות RNAi מורכבת משלושה אנשים: (1) אדם אחד עמדות כל סמן על סרט דביק כפול מודבקת פיסת שעווה שיניים אדום, (2) אדם אחד מזריק את קרציות ו (3) אדם אחד המסכים קרציות לאחר זריקה, נושם CO 2 על קרציות כדי להפעיל אותם וסופר את קרציות החיים לתוך כוסות תווית עם מספר קבוצת הניסוי. כל חברי הצוות חייבים ללבוש כפפות חד פעמיות. 2.3. המיקום של קרציות להזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת סמן באמצעות מלקחיים דומון בסדר למקם אותו בצד הגחון על סרט דביק כפול מודבקת גיליון 3 &quot;x 6&quot; של שעווה שיניים אדום. קרציות ממוקמים יחדיו בקבוצות של 5 קרציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רצועה קטנה של דבק על גפי כל 5 קרציות כדי לקדם לרסן אותם, אך תוך השארת רוב הגוף חשוף כל כך את תהליך ההזרקה ניתן לצפות על ידי סמן ההזרקה (איור 1). </li></ol> 2.4. הזרקה של קרציות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרציות יהיה להזריק ברבע הימני התחתון של משטח הגחון של שלד חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לנקב חור שלד באמצעות מזרק אינסולין Monoject מצויד ½ &quot;, 29 מחט מד (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק קרציות מיד עם μL 0.2-0.5 פתרון dsRNA (5 x אוקטובר 10-05 x 10 11 מולקולות לכל μL) באמצעות מזרק מחוייט עם המילטון 1 אינץ, 33 מחט מד עם נקודה 45 ° משופעים (איור 2b) . המחט צריך להיות ממוקם היטב לתוך חלל סמן כדי להבטיח את המיקום ושמירה של dsRNA. נוזל חלק עשוי להימלט מן הזריקה (איור 2 ג). יש להקפיד לא על להזריק את קרציות, אשר יגרום לאובדן hemolymph ועלולה לגרום למותם של סמן את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק המילטון לאחר סיום זריקות בכל קבוצה ניסיונית. לפני השימוש עבור קבוצה אחרת ניסיונית. מלאו את המזרק הראשון כוס המכילה מי חמצן 3% ולאחר מכן לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. מלאו את המזרק מתוך כוס המכילה מים סטריליים ואז לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. הקפד לא לכופף את הבוכנה של המזרק המילטון, כי אם כפופות, הבוכנה לא יעברו בצורה חלקה להגיב למגע עדין נדרש הזרקה של קרציות. </li></ol> 2.5. טיפול קרציות לאחר ההזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את סמן מוזרק מיד מהקלטת דביק כפול עם מלקחיים בסדר להניח אותו במיכל פלסטיק התאוששות (כ 6 &quot;x 6&quot; ועטור דבק כדי למנוע בריחה של קרציות). קרציות יהיה פעיל לזמן קצר לאחר ההזרקה, אבל צריך בקרוב להתחיל לזחול סביב המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נשימת CO 2 על קרציות מיד לאחר הצבתם במכולה התאוששות כדי לסייע להפעיל את קרציות. לאחר קרציות הן זחילה פעיל, הפצע יתרפא זריקה במהירות והם סביר להניח לשרוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן קרציות לפי מספר בכל קבוצה ניסיוניים ולמקם אותם בכוס פלסטיק עם מכסה שכותרתו צפופות. קרציות החלפת צריך להיות מוזרק להחליף כל שכל נפטר לפני הזרקת קבוצת הניסוי הבא. </li></ol> 2.6. סמן מחזיק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרציות בתא לחות (12hr אור: 12 שעות photoperiod כהה 22-25 ° C ו 95% h יחסיתumidity) והחזק ליום 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרציות מקום קרציות האכלה תאים, אחד לכל קבוצת הניסוי, דבוק כבשה ולאפשר להם להאכיל עם מספר שווה של קרציות זכר או נקבה uninjected (לפי המין לא היה מוזרק). קרציות נקבה כי להאכיל את גודש, אלה יוסרו מן הכבשים לאחר 10 ימים של האכלה או כאשר הנקבות לשלוט כבר הוריד את המארחת נאספים שקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרציות בקרטונים, והחזק בתא לחות עד השלמת ההטלה. הערכת ההטלה על ידי שקלול המוני ביצים המיוצר על ידי כל קרציות בקבוצה. </li></ol> 2.7. ניתוח של פנוטיפ סמן לאחר RNAi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת סמן פנוטיפ לאחר האכלה על ידי קביעת מספר קרציות ששרדו, משקל סמן, ההטלה והפוריות ביצה. עם זאת, ניתוחים אחרים עשויים להתבצע בהתאם הגן לבין מטרות ממוקדות של המחקר. </li></ol> 3. ניתוח לאשר השתקת הגן על ידי RT-PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח בלוטות הרוק ואת האומץ של קרציות בודדים מקבוצות שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק לאחר ההנקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית RNA הכולל דגימות רקמה בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תעתיקי גנים ברקמות יעד שונות על ידי זמן אמת RT-PCR ו לנרמל את רמות RNA נגד 16S rRNA סמן בשיטת genNorm (שיטת ddCT כמו מיושם על ידי Bio-Rad iQ5 Standard Edition, גרסה 2.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה על מנת להבטיח כי רק אחד amplicon נוצר וכי לפגל amplicons עקבי בטווח הטמפרטורה זהה עבור כל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את רמות ה-mRNA (מנורמל לערכי CT) בין שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק באמצעות קרציות הסטודנטים `s t-test (p = 0.05). </li></ol> 4. נציג תוצאות: פרוטוקול המתואר במסמך נעשה שימוש במעבדה שלנו RNAi ב שונה מינים רבים סמן ixodid (טבלה 1). כמות dsRNA מוזרק קרציות משתנה עם גודלו של סמן את; מינים סמן גדול יכול להכיל נפח גדול יותר. קרציות שליטה שלילי צריך להיות מוזרק עם dsRNA שאינו קשור. DsRNAs מספר כגון subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ו בטא אקטין 20,21 יכול לשמש שולטת חיובית. שים לב, חשוב לשטוף את המזרק בין הטיפולים, כדי למנוע ערבוב פתרונות dsRNA. אם הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, פחות מ 5% תמותה יש לקבל זריקה ההליך לאחר 24 שעות. פנוטיפ אופייני אחרי מציאה גן קרציות מוצג באיור 3 עם פאנל של קרציות מוזרק עם בריכות של dsRNA כדי המסך סמן אנטיגנים מגן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סמן מינים </td><td> dsRNA מוזרק </td><td> הפניות </td></tr><tr><td> קרצית scapularis </td><td> ספריית cDNA, subolesin, אקטין, nucleotidase, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, היוביקוויטין, vATPase, selenoproteins M ו W2a, hematopoietic גזע / ובתאים דמוי חלבון, למקטע אקטין פרוטאזום 26S, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> ספריית cDNA, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST, היוביקוויטין, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, העיכול, GIII, EF1a, חלבון flagelliform משי, von Willebrand גורם </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> היוביקוויטין, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. טיק מינים שבהם פרוטוקול RNAi כבר בשימוש. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. המיקום של קרציות, בצד הגחוני מעלה, בקלטת דביק כפול דבק גיליון של שעווה שיניים אדום. קרציות מוצבים בקבוצות של 5, לאחר מכן רצועה קטנה של דבק מונח על גפי על מנת להבטיח את המשך קרציות תוך מתן מזרק כדי לשמור על הגוף במהלך סמן את הזריקה. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ההליך כולל הזרקה (א) פירסינג ברבע הימני התחתון של שלד חיצוני לתקתק עם אינסולין סאיringe מצויד במחט 29 מד כדי ליצור אתר הזרקה, (ב) הזרמה מיידית של dsRNA באתר זה בעזרת מזרק עם מחט המילטון 33 מד אשר (ג) קרוב לוודאי תגרום לדליפת חלק hemolymph סמן / נוזלים. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. פאנל של שש קבוצות סמן שבו RNAi שימש המסך אנטיגנים סמן המגן Amblyomma americanum. השינויים פנוטיפי ב קרציות ניתן לראות בהשוואה חיובי subolesin RNAi מלאה שליטה שלילי dsRNA קשור. בניסוי זה ההשפעה של RNAi על התמותה סמן, משקולות, ו ההטלה של כל קבוצה נותח סטטיסטית.

<ol>
	<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals.">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li><li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mosquito+control-Lessons+from+the+past,+solutions+for+the+future.">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li><li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names.">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li><li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+control:+Thoughts+on+a+research+agenda.">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li><li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species.">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions.">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li><li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+Drosophila.">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li><li>Mello, C. C., Conte, D. J. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+world+of+RNA+interference.">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+and+potential+applications.">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li><li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research.">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li><li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+applicability+in+tick+research.">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li><li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+ticks:+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum.">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks.">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen,+Anaplasma+marginale.">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li><li>Almaz&#228;N, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations.">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick,+Amblyomma+americanum.">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale.">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin.">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference.">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens.">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tick+protective+antigen,+4D8,+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction.">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference.">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference.">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li><li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86,+Bm91+and+subolesin,+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens.">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+defensin,+varisin,+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections.">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression.">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li><li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+(Acari:+Ixodidae)+on+female+engorgement+and+oviposition.">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li><li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates.">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li><li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen,+subolesin.">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis.">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks.">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li><li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+tool:+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA.">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA.">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies.">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li><li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila.">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות שיטות אחרות תוארו עבור RNAi ב 14 קרציות, 33, הזרקה של dsRNA המתואר כאן הוא הנפוץ ביותר הן יאכילו (טבלה 1) והאכילה קרציות 16,25,34. RNAi הוכח להיות כלי רב ערך לחקר תפקוד הגן סמן על האפיון של ממשק קרציות הפתוגן והקרנת ואפיון של אנטיגנים סמן מגן 14,35. בפרט, RNAi הפך כלי חשוב ביותר עבור ניתוחים תפקודית קרציות 35. מתודולוגית, RNAi צפוי להתפתח שיטות יעילות יותר עשוי לאפשר מציאה גן במספר רב של אנשים. המנגנון של dsRNA-Induced RNAi ב קרציות צריך להיות מעודן לתרום להבנה טובה יותר וניצול של גישה זו הגנטי מין זה 35,36. היקף מחוץ היעד ההשפעות של RNAi ב קרציות היא גם שאלה חשובה, כי יש לטפל באופן מלא 14,27. לבסוף, RNAi סביר להניח לספק תרומות מקיף ללימוד תקנה סמן גנטי וביולוגיה מערכות קרציות הפתוגן ממשק עלולה להיות השפעה על התפתחות של חיסונים כדי לשלוט מכת סמן והעברת סמן נישאים פתוגנים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Access RT-PCR system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A1250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purelink PCR purification kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K3100-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript RNAi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1626M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red dental wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic cups, 1.25 oz and lids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Monoject</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fitted with a &frac12;&#x201D;, 29 gauge needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>701SN,33/.375&#x201D;/45DGR</td>
<td>Custom made</td>
</tr>
<tr>
<td>TriReagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>93289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8892</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Real-time PCR detection system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>Several</td>
<td>Please refer to <a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna interference in ticks

קרציות הן ectoparasites hematophagous מחייבת של חיות ובני אדם בר מקומיים, נחשבים ברחבי העולם השנייה יתושים כמו וקטורים של מחלות אנושיות 1 ואת הווקטורים החשובים ביותר המשפיעים על תעשיית הבקר העולמית 2. קרציות מסווגים תת Acari, Parasitiformes סדר, suborder Ixodida ו מופצים ברחבי העולם מן הקוטב הצפוני אל באזורים טרופיים 3. למרות המאמצים לשלוט מכת קרציות, ectoparasites אלה נשארים בעיה חמורה לבריאות בני אדם ובעלי חיים 4,5. התערבות RNA (RNAi) 6 היא גישה המבוססת על גרעין חומצה הפוך גנטי כרוך שיבוש של ביטוי גנים על מנת לקבוע תפקוד הגן או את השפעתו על מסלול מטבולי. RNAs התערבות קטנה (siRNAs) הם מולקולות של מפעיל מסלול RNAi כי הוא שיזם פעמיים תקועים RNA (dsRNA) ותוצאות השפלה עוצמה רצף ספציפי של mRNAs cytoplasmic המכיל את רצף זהה ההדק dsRNA 7-9. פוסט תעתיק להשתקת גנים מנגנוני ביוזמת dsRNA התגלו אאוקריוטים כל למד עד כה, RNAi פותחה במהירות ככלי ללימודי גנומיקה תפקודית יישומים אחרים 10 במגוון רחב של אורגניזמים. RNAi הפך הנפוצה ביותר גנים והשתקת טכניקה קרציות ואורגניזמים אחרים בו גישות חלופיות עבור מניפולציה גנטית אינם זמינים או 5,11 אמין. אפיון גנטי של קרציות הוגבל עד הבקשה האחרונה של RNAi 12,13. בזמן הקצר הזה RNAi כבר זמין, הוא הוכיח את עצמו להיות כלי רב ערך ללימוד פונקציה סמן גנטי, אפיון של ממשק קרציות הפתוגן והקרנת ואפיון של אנטיגנים סמן מגן 14. בזאת, שיטה עבור RNAi באמצעות הזרקה של dsRNA לתוך קרציות יאכילו מתואר. סביר להניח כי הידע שנרכש גישה זו הניסוי יתרום משמעותית להבנה של מערכות ביולוגיות בסיסיות ופיתוח של חיסונים כדי לשלוט מכת סמן ולמנוע העברת סמן נישאים פתוגנים 15-19.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Ticks at JoVE.com

RNA Interference in Ticks

השיטה של ​​התערבות RNA (RNAi) בזריקה של dsRNA לתוך קרציות יאכילו מתואר. RNAi היא הנפוצה ביותר גנים והשתקת טכניקה קרציות שם שימוש בשיטות אחרות של מניפולציה גנטית הוגבל.

RNA התערבות קרציות

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...