Name: rna interference in ticks
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Ticks at JoVE.com

Мы благодарим членов нашей лаборатории для плодотворных дискуссий и технической помощи. Это видео презентация была поддержана заместителем декана по научной и департамент ветеринарной патобиологии, Центр ветеринарной медицинских наук, Государственный университет Оклахомы. Исследование финансировалось Ministerio де Ciencia электронной Innovación, Испания (проект BFU2008-01244/BMC), CSIC очной проекта PA1002451 к JF, Уолтер Р. Sitlington Обладая кафедры пищевых исследований животных на КМК, 2009 CVHS RAC грант, OAES Здоровье животных фондов и Министерства сельского хозяйства США, Национальный исследовательский инициатива Конкурентные Грант, № 2007-04613.

1. Генерация дсРНК. <ol><li> Синтез олигонуклеотидных праймеров, содержащих последовательности T7 промотор для транскрипции в пробирке и синтез дсРНК (например, для Dermacentor variabilis subolesin использованием олигонуклеотидных праймеров D8AAT75: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 &#39;и D8DVT73: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3&#39;). </li><li> Amplify гена-мишени ОТ-ПЦР, используя 10 пмоль каждого праймера и олигонуклеотида 1-10 нг РНК тик общего количества. </li><li> Purify продукта ПЦР. </li><li> Обобщить дсРНК использовании 8 мкл продукта ПЦР очищенная. </li><li> Количественная дсРНК по-спектрометрии. </li></ol> 2. Инъекция тики с дсРНК. 2.1. Подготовка клещей для инъекций. <ol><li> Во-первых, мыть клещей в серии решений, встряхивая их в каждом решении в 50 мл одноразовые трубки центрифуги, разливая раствор через мелкое сито проволочной сетки по трубке сверху сохранить клещей. Последовательность решений для мытья клещей водопроводной воды, 3% перекись водорода, два моет дистиллированной воды, 70% этанола и еще два моет дистиллированной водой. </li><li> Пятно сухой клещей на бумажных полотенцах. </li><li> Граф клещей на группы от 20 до 50, в зависимости от эксперимента, место клещей из каждой группы в 1,25 пластиковом стакане г с подогнаны крышки и этикетки с экспериментальными номер группы. </li></ol> 2.2. Тик инъекции команды. Команда RNAi состоит из трех человек: (1) один человек, который позиции каждого тика на двойной клейкой ленты прикреплены к листу красной зубных слепков, (2) один человек, который вводит клещей и (3) один человек, который следит за клещей после инъекции, дышит CO 2 на клещей, чтобы активировать их и подсчитывает жизни клещей в чашки помечены экспериментальные номер группы. Все члены команды должны носить одноразовые перчатки. 2.3. Размещение клещей для инъекций. <ol><li> Захват тик использованием Дюмон штраф пинцетом и поместить его брюшной стороне на двойной клейкой ленты прикреплены к 3 &quot;х 6&quot; лист красной стоматологического воска. Клещей близко расположены вместе в группы по 5 клещей. </li><li> Место небольшую полоску клейкой ленты на ротовых всех 5 тиков в целях дальнейшего удержать их, но, оставляя большую часть тела подвергается, так что инъекции процесс можно наблюдать тик инжектора (рис. 1). </li></ol> 2.4. Инъекция клещей. <ol><li> Тиков будет введен в правом нижнем квадранте брюшной поверхности экзоскелет. </li><li> Во-первых, пробить отверстие в экзоскелет с помощью шприца Monoject инсулина оснащены ½ &quot;, 29 иглы (рис. 2а). </li><li> Inject клещей сразу же с 0,2-0,5 мкл раствора дсРНК (5 х 10 10 - 5 х 10 11 молекул в мкл) с использованием заказных Гамильтон шприц с 1 дюйм, 33 иглы с 45 ° скошенной точке (рис. 2б) . Иглы должны быть размещены также в тик полости, чтобы обеспечить размещение и хранение дсРНК. Некоторые жидкости, скорее всего, побег из места инъекции (рис. 2в). Следует проявлять осторожность, чтобы не вводить в течение клещей, которые будут вызывать потерю гемолимфы и может привести к гибели клеща. </li><li> Чистая шприца Гамильтона после окончания инъекций в каждой экспериментальной группы. Перед использованием для другой экспериментальной группе. Заполните шприц сначала из стакана, содержащий 3% перекиси водорода, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Заполните шприц из стакан, содержащий стерильной водой, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Будьте осторожны, чтобы не погнуть поршень шприца Гамильтона, потому что, если изогнуты, поршень не будет двигаться плавно и реагировать на нежные прикосновения, необходимых для введения клещей. </li></ol> 2.5. Лечение клещей после инъекции. <ol><li> Возьмите вводят непосредственно из тика двойной клейкой ленты с тонким пинцетом и поместить его в пластиковый контейнер восстановления (примерно 6 &quot;х 6&quot; и кольчатой ​​с клейкой лентой, чтобы предотвратить побег клещи). Клещи будут кратко неактивные после инъекции, но в ближайшее время должен начать ползать блюдо. </li><li> Дыхание CO 2 на клещей сразу же после помещения их в контейнер для восстановления помочь активировать клещей. Как только клещи ползут и активным, инъекции рана будет заживать быстрее, и они, скорее всего, выжить. </li><li> Граф клещей в зависимости от количества в каждой экспериментальной группы и поместите их в пластиковый стаканчик помечены с подогнаны крышкой. Замена клещей должен быть введен, чтобы заменить какой-либо, что любой умер перед инъекцией следующего экспериментальной группе. </li></ol> 2.6. Тик холдинга. <ol><li> Место клещей в камере влажности (12hr свет: 12 ч темно фотопериода на 22-25 ° С и 95% относительной чumidity) и удерживайте в течение 1 дня. </li><li> Место клещей в тик-питание клеток, по одному в экспериментальной группе, приклеены к овцам и дать им возможность кормиться с равным количеством uninjected мужчина или женщина клещей (в зависимости от пола не вводили). Женский клещи, которые питаются в сытости, те, которые удаляются из овец через 10 дней после кормления или когда контроль самок высадили хост собираются и взвешиваются. </li><li> Место клещей в картонных коробках, и держать в камере влажности до окончания яйцекладки. Оценка откладки яиц путем взвешивания яичная масса производимого всеми клещей в группе. </li></ol> 2.7. Анализ клеща фенотипа после RNAi. <ol><li> Оценка тик фенотипа после кормления, определяя количество тактов, которые выжили, отметьте вес, откладки яиц и яичных плодородия. Тем не менее, другие анализы могут быть выполнены в зависимости от целевого гена и задачи исследования. </li></ol> 3. Анализ для подтверждения генов ОТ-ПЦР. <ol><li> Рассеките слюнных желез и кишки от отдельных клещей из-под контроля впрыска и дсРНК впрыском групп после кормления. </li><li> Извлечение общей РНК из отдельных образцов ткани. </li><li> Анализ стенограмм гена-мишени в отдельных тканей в режиме реального времени RT-PCR и нормализовать уровни РНК против клещевого 16S рРНК использованием genNorm метод (метод ddCT как осуществляется Bio-Rad iQ5 Standard Edition, версия 2.0). </li><li> Выполнить диссоциации кривых в конце реакции, чтобы только один ампликона формируется и что ампликонов денатурировать последовательно в том же диапазоне температур для каждого образца. </li><li> Сравнить уровни мРНК (нормированные значения Ct) между контролем впрыском и дсРНК впрыском клещей использованием Студенческие т-тест (р = 0,05). </li></ol> 4. Представитель Результаты: Протокол, описанный в этом документе, были использованы в нашей лаборатории для RNAi в самых разных видов иксодовых тики (табл. 1). Количество дсРНК вводят клещей зависит от размера тика; больше видов клещей может вместить больший объем. Отрицательные клещей контроль должен быть введен с несвязанными дсРНК. Несколько dsRNAs таких как subolesin 14-19,22-25,27-32,34 и бета-актин 20,21 можно использовать в качестве положительного контроля. Обратите внимание, что очень важно, чтобы вымыть шприц между курсами лечения, чтобы избежать смешивания растворов дсРНК. Если протокол будет сделано правильно, менее чем на 5% смертности должны быть получены из процедуры инъекции через 24 часа. Типичный фенотип гена после нокдауна в тактах показано на рисунке 3 с панели клещи вводят пулов дсРНК для того, чтобы показать на экране для клещ защитных антигенов. <table border="1"><tbody><tr><td> Тик видов </td><td> дсРНК вводили </td><td> Ссылки </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> кДНК библиотеки, subolesin, актин, нуклеотидазы, NF-Кб, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, убиквитин, vATPase, селенопротеинов M и W2A, гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток белка, как, актин протеасомы 26S субъединицы, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> кДНК библиотеки, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus шпеиз </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus MicroPlus </td><td> GST, убиквитин, селенопротеина, Bm86, Bm91, subolesin Г.И., GIII, EF1a, жгутовидные шелковые белка, фон Виллебранда фактор </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus аппиШиз </td><td> убиквитин, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Tick видов, в которых РНК-интерференции протокол был использован. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Размещение клещей, вентральной стороной вверх, на двойной клейкой лентой придерживался лист красной стоматологического воска. Клещей помещаются в группы по 5, после чего небольшую полоску клейкой ленты находится над ротовые в целях дальнейшего безопасного клещей, позволяя наблюдать инжектор тело клеща во время инъекции. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Инъекции процедура включает в себя (а) пирсинг правом нижнем квадранте тик экзоскелет с инсулином сиRinge оснащен 29 иглу, чтобы создать месте инъекции, (б) немедленное введение дсРНК на этом сайте, используя шприц Гамильтон с 33 иглы которых (с), скорее всего, приведет к некоторой утечке клещей гемолимфы / жидкости. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Панели клещей шесть групп, в которых РНК-интерференции был использован для выявления тик защитных антигенов в Amblyomma americanum. Фенотипические изменения у клещей можно увидеть при сравнении с положительным subolesin RNAi контроля и отрицательных связанных контроль дсРНК. В этом эксперименте влияние RNAi в кредит смертности, веса и откладки яиц в каждой группе было статистически проанализированы.

<ol>
	<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals.">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li><li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mosquito+control-Lessons+from+the+past,+solutions+for+the+future.">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li><li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names.">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li><li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+control:+Thoughts+on+a+research+agenda.">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li><li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species.">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions.">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li><li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+Drosophila.">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li><li>Mello, C. C., Conte, D. J. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+world+of+RNA+interference.">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+and+potential+applications.">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li><li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research.">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li><li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+applicability+in+tick+research.">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li><li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+ticks:+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum.">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks.">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen,+Anaplasma+marginale.">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li><li>Almaz&#228;N, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations.">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick,+Amblyomma+americanum.">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale.">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin.">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference.">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens.">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tick+protective+antigen,+4D8,+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction.">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference.">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference.">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li><li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86,+Bm91+and+subolesin,+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens.">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+defensin,+varisin,+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections.">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression.">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li><li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+(Acari:+Ixodidae)+on+female+engorgement+and+oviposition.">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li><li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates.">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li><li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen,+subolesin.">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis.">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks.">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li><li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+tool:+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA.">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA.">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies.">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li><li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila.">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Хотя другие методы были описаны для RNAi в 14 клещей, 33, инъекции дсРНК описанная здесь наиболее широко используется как в голодные (табл. 1) и подается клещей 16,25,34. RNAi было показано, что ценный инструмент для исследования клещей функции гена, характеристика клеща возбудителя интерфейс и отбор и характеристика тик защитных антигенов 14,35. В частности, RNAi стал самым ценным инструментом для функционального анализа в клещи 35. Методологически RNAi, скорее всего, превратится в более эффективных методов, которые могут позволить гена нокдаун в большое количество людей. Механизм дсРНК вызванные РНК-интерференции в тиках следует доработать, чтобы способствовать лучшему пониманию и использованию этого генетического подхода у этого вида 35,36. Степень вне целевой эффекты RNAi в тактах также важный вопрос, который должен быть полностью рассмотрены 14,27. Наконец, RNAi, скорее всего, обеспечить всестороннюю вклад в изучение клещей регуляции генов и системной биологии и клещей возбудитель интерфейс и может иметь влияние на разработку вакцин для контроля тик заражения и передачи клещевого патогенов.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Access RT-PCR system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A1250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purelink PCR purification kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K3100-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript RNAi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1626M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red dental wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic cups, 1.25 oz and lids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Monoject</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fitted with a &frac12;&#x201D;, 29 gauge needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>701SN,33/.375&#x201D;/45DGR</td>
<td>Custom made</td>
</tr>
<tr>
<td>TriReagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>93289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8892</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Real-time PCR detection system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>Several</td>
<td>Please refer to <a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna interference in ticks

Клещи являются облигатными гематофагами эктопаразиты диких и домашних животных и людей, и считается вторым по всему миру для комаров как переносчиков болезней человека, 1 и наиболее важных векторов, влияющих скота промышленности во всем мире 2. Клещи, классифицируются в подклассе Acari, порядок Parasitiformes, подотряда Ixodida и распространяются по всему миру от Арктики до тропических регионах 3. Несмотря на усилия по контролю тик насекомых, это эктопаразитов остаются серьезной проблемой для здоровья человека и животных 4,5. РНК-интерференция (RNAi) 6 на основе нуклеиновой кислоты обратный генетический подход, который включает в себя нарушение экспрессии генов, чтобы определить функции гена или его влияние на метаболические пути. Малых интерферирующих РНК (siRNAs) являются эффекторные молекулы путем РНК-интерференции, который проводится по инициативе двухцепочечной РНК (дсРНК) и приводит к мощным последовательности конкретных деградации мРНК, содержащих цитоплазматические же последовательности, что триггером дсРНК 7-9. После транскрипционных генов механизмы инициирован дсРНК были обнаружены у всех эукариот изучены до сих пор, и RNAi была быстро развивается в самых разных организмов, как инструмент для исследования функциональной геномики и других приложений, 10. RNAi стало наиболее широко используемых генной глушителей технику в клещи и другие организмы, где альтернативные подходы в генетических манипуляций отсутствуют или являются ненадежными 5,11. Генетической характеристики клещей было ограничено до недавнего применения РНК-интерференции 12,13. В короткое время, что RNAi была доступна, она оказалась ценным инструментом для изучения функции генов тик, характеристика клеща возбудителя интерфейс и отбор и характеристика тик защитных антигенов 14. При этом, метод РНК-интерференции путем инъекции дсРНК в голодные клещи описано. Вполне вероятно, что знания, полученные из этого экспериментальный подход будет способствовать заметно на понимание основных биологических систем и разработка вакцин для контроля тик инвазии и предотвращения передачи клещевого патогенов 15-19.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Ticks at JoVE.com

RNA Interference in Ticks

Метод РНК-интерференции (RNAi) путем инъекции дсРНК в голодные клещи описывается. RNAi является наиболее широко используемой генной глушителей технику в клещи, где использование других методов генетических манипуляций носит ограниченный характер.

РНК-интерференция в клещи

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Развитие сотового типа конкретных анти-ВИЧ gp120 аптамеры для доставки миРНК

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Кормление клещей на животных для передачи и ксенодиагностика в Лайма исследования заболеваний

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

РНК Очистка от внутриклеточно Grown<em&gt; листерий</em&gt; В клетках макрофагальной

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...