Name: rna interference in ticks
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Ticks at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i våra laboratorier för givande diskussioner och tekniskt bistånd. Denna video presentation stöddes av Associate Dean för forskning och Institutionen för veterinärmedicinska Patobiologi, Centrum för veterinär Health Sciences, Oklahoma State University. Forskningen har finansierats av Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanien (projekt BFU2008-01244/BMC), den CSIC intramural projektet PA1002451 till JF, begåvad Walter R. Sitlington ordförande för livsmedel djurförsök till KMK, CVHS 2009 RAC bidrag, OAES djurhälsa Fonder och USDA, National Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant, nr 2007 till 04.613.

1. Generering av dsRNA. <ol><li> Syntetisera oligonukleotid grundfärger innehåller T7 promotorn sekvenser för in vitro transkription och syntes av dsRNA (till exempel för Dermacentor variabilis subolesin använda oligonukleotid grundfärger D8AAT75: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 &quot;och D8DVT73: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3). </li><li> Amplify målgenen med RT-PCR, med 10 pmol för varje oligonukleotid primer och 1-10 ng av RNA fästing totalt. </li><li> Rena PCR-produkten. </li><li> Syntetisera dsRNA med 8 mikroliter av det renade PCR-produkten. </li><li> Kvantifiera dsRNA av spektrometri. </li></ol> 2. Injektion av fästingar med dsRNA. 2,1. Beredning av fästingar för injektion. <ol><li> Först, tvätta fästingar i en serie av lösningar genom att skaka dem i varje lösning i en 50 ml för engångsbruk centrifugrör, dekantering lösningen genom ett finmaskigt gallervägg över röret toppen att behålla fästingar. Sekvensen av lösningarna för att tvätta fästingar är kranvatten, 3% väteperoxid, två tvättar med destillerat vatten, 70% etanol och två tvättar med destillerat vatten. </li><li> Blot-torka fästingar på hushållspapper. </li><li> Räkna fästingar i grupper på 20 till 50, beroende på experimentet, placera fästingar från varje grupp i en 1,25 oz plastmugg med ett tätt monterade lock och etikett med den experimentella gruppnummer. </li></ol> 2,2. Kryssa injektion laget. Den RNAi lag består av tre personer: (1) en person som positioner varje fästing på dubbel tejp som fästs på ett blad av röd dentalvax, (2) en person som sprutar in fästingar och (3) en person som övervakar fästingar efter injektion, andas CO 2 på fästingar för att aktivera dem och räknar levande fästingar i koppar märkta med den experimentella gruppnummer. Alla lagmedlemmar måste använda engångshandskar. 2,3. Placering av fästingar för injektion. <ol><li> Fånga en fästing med Dumont fin pincett och placera den ventrala sidan upp på dubbel tejp som fästs på en 3 &quot;x 6&quot;-ark av rött dentala vax. Den fästingar är nära placerade tillsammans i grupper om 5 fästingar. </li><li> Placera en liten remsa maskeringstejp över den mouthparts av alla 5 fästingar för att ytterligare hålla tillbaka dem, men samtidigt större delen av kroppen utsättas för, så att injektionen processen kan observeras av fästingen injektorn (Figur 1). </li></ol> 2,4. Injektion av fästingar. <ol><li> Fästingarna kommer att injiceras i nedre högra kvadranten av ventrala yta exoskelett. </li><li> Först, stick ett hål i exoskelett med hjälp av en Monoject insulin spruta med ett ½ &quot;, 29 gauge nål (Figur 2a). </li><li> Injicera fästingar omedelbart med 0,2-0,5 ìl dsRNA lösning (5 x 10 till 5 Oktober x 10 11 molekyler per mikroliter) med en skräddarsydd Hamilton spruta med en 1 tum, 33 gauge kanyl med en 45 ° fasad punkt (figur 2b) . Nålen bör placeras långt in fästingen hålighet att försäkra placering och bibehållande av dsRNA. En del vätska kommer sannolikt att fly från injektionsstället (Figur 2c). Försiktighet bör iakttas inte över injicera fästingar, vilket skulle orsaka förlust av hemolymph och kan orsaka död på fästingen. </li><li> Rengör Hamilton sprutan efter avslutad injektion i varje försöksgrupp. innan du använder för en annan experimentell grupp. Fyll sprutan först från en bägare som innehåller 3% väteperoxid och sedan utvisa till ett avfallskärl, och upprepa 15 gånger. Fyll sprutan från en bägare som innehåller sterilt vatten och sedan utvisa in i en papperskorg, och upprepa 15 gånger. Var noga med att inte böja kolven i Hamilton sprutan, för om böjda, kommer kolven inte rör sig smidigt och svara på lätt beröring krävs för injektion av fästingar. </li></ol> 2,5. Behandling av fästingar efter injektionen. <ol><li> Plocka upp den injicerade fästingen omedelbart från dubbel tejp med fin pincett och placera den i en plast återhämtning behållare (ca 6 &quot;x 6&quot; och vikare med maskeringstejp för att förhindra flykt av fästingar). Fästingarna kommer att kortfattat inaktiv efter injektion men ska snart börja krypa runt i skålen. </li><li> Breath CO 2 på fästingar direkt efter att placera dem i återvinningen behållaren för att aktivera fästingar. När fästingar är krypande och aktiva kommer injektionen såret läker snabbt och de kommer sannolikt att överleva. </li><li> Räkna fästingar efter antalet i varje försöksgrupp och placera dem i en märkt plastmugg med ett tätt monterade lock. Byte fästingar ska injiceras för att ersätta alla att någon dog innan injicera nästa försöksgruppen. </li></ol> 2,6. Tick ​​innehav. <ol><li> Placera fästingar i en fuktkammare (12tim ljus: 12 tim mörkt fotoperiod vid 22-25 ° C och 95% relativ humidity) intryckt i 1 dag. </li><li> Placera fästingar i tick-utfodring celler, en per experimentell grupp, limmas på ett får och låta dem foder med ett lika stort antal uninjected manliga eller kvinnliga fästingar (beroende på vilket kön inte injicerades). Kvinna fästingar som foder för att fylla upp, har de som tas bort från fåren efter 10 dagars utfodring eller när kontrollen honorna somnade värden samlas in och vägs. </li><li> Placera fästingar i kartonger, och håll i fuktig kammare till dess att äggläggning. Utvärdera äggläggning genom att väga ägget massproducerade av alla fästingar i gruppen. </li></ol> 2,7. Analys av fästing fenotypen efter RNAi. <ol><li> Utvärdera kryssa fenotypen efter utfodring genom att bestämma hur många fästingar som överlevde, kryssa vikt, äggläggning och ägg fertilitet. Dock kan andra analyser göras beroende på riktade genen och målen för studien. </li></ol> 3. Analys för att bekräfta utsläckning av geners uttryck med RT-PCR. <ol><li> Dissekera spottkörtlar och inälvor från enskilda fästingar från kontroll-injiceras och dsRNA-injiceras grupper efter utfodring. </li><li> Utdrag totala RNA från enskilda vävnadsprover. </li><li> Analysera avskrifter målgenen i enskilda vävnader genom realtids-RT-PCR och normalisera RNA-nivåer mot fästing 16S rRNA med genNorm metoden (ddCT metod som genomförts av Bio-Rad iQ5 Standard Edition, version 2.0). </li><li> Kör dissociation kurvor i slutet av reaktionen att säkerställa att endast en amplicon bildas och att amplicons denaturera konsekvent i samma temperatur för varje prov. </li><li> Jämför mRNA nivåer (normaliserade Ct-värden) mellan kontroll-injiceras och dsRNA-injiceras fästingar med Student `s t-test (P = 0,05). </li></ol> 4. Representativa resultat: Protokollet som beskrivs här har använts i vårt laboratorium för RNAi i många olika ixodid fästing arter (tabell 1). Mängden dsRNA injiceras i fästingar varierar med storleken på fästingen, större fästing arter kan rymma en större volym. Negativa kontrollen fästingar bör injiceras med en orelaterad dsRNA. Flera dsRNAs som subolesin 14-19,22-25,27-32,34 och beta-aktin 20,21 kan användas som positiva kontroller. Observera att det är viktigt att tvätta sprutan mellan behandlingarna för att undvika att blanda dsRNA lösningar. Om protokollet är gjort rätt ska mindre än 5% dödlighet erhållas från injektionsproceduren efter 24 timmar. En typisk fenotyp efter genen ÖVERVÄLDIGANDE i fästingar visas i figur 3 med en panel av fästingar injiceras med pooler av dsRNA för att screena för fästingen skyddande antigener. <table border="1"><tbody><tr><td> Tick ​​arter </td><td> dsRNA injiceras </td><td> Referenser </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> cDNA bibliotek, subolesin, aktin, nukleotidas, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, ubiquitin, vATPase, selenoproteins M och W2a, hematopoetisk stamcellstransplantation / progenitorceller protein-liknande, aktin proteasom 26S subenheten, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> cDNA bibliotek, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus MicroPlus </td><td> GST, ubiquitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform silkesprotein, von Willebrands faktor </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> ubiquitin, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Tick arter där RNAi protokoll som har använts. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Placering av fästingar, ventrala uppåt på dubbel tejp följs ett ark rött dentala vax. Den fästingar är placerade i grupper om 5, varefter en liten remsa maskeringstejp placeras över mouthparts för att ytterligare säkra fästingar samtidigt som injektorn att observera kroppen på fästingen under injektion. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Injektionsproceduren innefattar (a) piercing det nedre högra kvadranten av fästingen exoskelett med insulin SYRinge utrustad med en 29 nål för att skapa en injektionsstället, (b) omedelbar injektion av dsRNA på denna webbplats med hjälp av en Hamilton spruta med en 33 gauge nål som (c) sannolikt kommer att resultera i några läckage av fästing hemolymph / vätskor. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. En panel av fästing sex grupper där RNAi använts för att screena för kryssa skyddande antigener i Amblyomma americanum. De fenotypiska förändringarna i fästingar kan ses i jämförelse med den positiva subolesin RNAi kontroll och den negativa oberoende dsRNA kontroll. I detta experiment effekten av RNAi på fästing dödlighet, vikter och äggläggning i varje grupp var statistiskt analyserats.

<ol>
	<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals.">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li><li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mosquito+control-Lessons+from+the+past,+solutions+for+the+future.">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li><li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names.">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li><li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+control:+Thoughts+on+a+research+agenda.">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li><li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species.">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions.">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li><li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+Drosophila.">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li><li>Mello, C. C., Conte, D. J. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+world+of+RNA+interference.">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+and+potential+applications.">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li><li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research.">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li><li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+applicability+in+tick+research.">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li><li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+ticks:+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum.">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks.">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen,+Anaplasma+marginale.">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li><li>Almaz&#228;N, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations.">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick,+Amblyomma+americanum.">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale.">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin.">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference.">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens.">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tick+protective+antigen,+4D8,+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction.">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference.">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference.">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li><li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86,+Bm91+and+subolesin,+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens.">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+defensin,+varisin,+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections.">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression.">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li><li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+(Acari:+Ixodidae)+on+female+engorgement+and+oviposition.">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li><li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates.">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li><li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen,+subolesin.">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis.">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks.">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li><li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+tool:+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA.">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA.">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies.">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li><li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila.">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li></ol>

Även andra metoder har beskrivits för RNAi i fästingar 14, 33, beskrev injektion av dsRNA här är det mest använda i både unfed (tabell 1) och matas fästingar 16,25,34. RNAi har visat sig vara ett värdefullt verktyg för studier av fästingen geners funktion, karakteriseringen av tick-patogen gränssnitt och screening och karakterisering av fästing skyddande antigen 14,35. Framför allt har RNAi blivit den mest värdefullt verktyg för funktionella analyser i fästingar 35. Metodiskt kommer RNAi utvecklas sannolikt till mer effektiva metoder som kan tillåta genen ÖVERVÄLDIGANDE i ett stort antal individer. Mekanismen för dsRNA-inducerad RNAi i fästingar bör förfinas för att bidra till en bättre förståelse och utnyttjande av denna genetiska tillvägagångssätt i denna art 35,36. Omfattningen av off-target effekter av RNAi i fästingar är också en viktig fråga som måste angripas fullt ut 14,27. Slutligen kommer RNAi sannolikt ge omfattande bidrag till studiet av fästingen genreglering och systembiologi och fästingen-patogen gränssnitt och kan ha en inverkan på utvecklingen av vacciner för att styra kryssa infestationer och överföring av fästingburna patogener.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Access RT-PCR system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A1250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purelink PCR purification kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K3100-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript RNAi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1626M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red dental wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic cups, 1.25 oz and lids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Monoject</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fitted with a &frac12;&#x201D;, 29 gauge needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>701SN,33/.375&#x201D;/45DGR</td>
<td>Custom made</td>
</tr>
<tr>
<td>TriReagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>93289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8892</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Real-time PCR detection system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>Several</td>
<td>Please refer to <a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna interference in ticks

Fästingar är obligata hematophagous ektoparasiter av vilda och tama djur och människor, och anses vara andra världen över att myggor som vektorer av sjukdomar hos människan 1 och våra viktigaste faktorer som påverkar boskap över hela världen 2. Fästingar klassificeras i underklassen Acari, Parasitiformes ordning, underordning Ixodida och distribueras över hela världen från Arktis till tropiska regioner 3. Trots ansträngningar att kontrollera fästing angrepp, dessa ektoparasiter är fortfarande ett allvarligt problem för människors och djurs hälsa 4,5. RNA-interferens (RNAi) 6 är en nukleinsyra baserad omvänd genetisk strategi som omfattar störningar av genuttryck för att bestämma geners funktion och dess effekt på en metabolismväg. Små störande RNA (siRNA) är effektor molekyler av RNAi väg som initieras av dubbelsträngat RNA (dsRNA) och resulterar i en potent sekvensspecifika nedbrytning av cytoplasmiska mRNA som innehåller samma sekvens som dsRNA utlösa 7-9. Post-transkription geners uttryck mekanismer initieras av dsRNA har upptäckts i alla eukaryoter studerat hittills, och RNAi har snabbt utvecklats i en mängd olika organismer som ett verktyg för funktionsgenomik studier och andra program 10. RNAi har blivit det mest använda gener tystas teknik i fästingar och andra organismer där alternativa metoder för genetisk manipulation inte är tillgängliga eller är otillförlitliga 5,11. Den genetiska karakterisering av fästingar har begränsats till aktuell tillämpning av RNAi 12,13. Under den korta tid som RNAi har funnits, har det visat sig vara ett värdefullt verktyg för att studera funktionen kryssa gen, en karakterisering av den fästingburna patogen gränssnitt och screening och karakterisering av fästing skyddande antigen 14. Häri, är en metod för RNAi genom injektion av dsRNA i unfed fästingar beskrivs. Det är troligt att de kunskaper som förvärvats från denna experimentella strategi kommer att bidra markant till förståelsen av grundläggande biologiska system och utveckling av vacciner för att styra fästing angrepp och förhindra överföring av fästingburna patogener 15-19.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Interference in Ticks at JoVE.com

RNA Interference in Ticks

En metod för RNA-interferens (RNAi) genom injektion av dsRNA till unfed fästingar beskrivs. RNAi är den mest använda gener tystas teknik i fästingar där användningen av andra metoder för genetisk manipulation har varit begränsade.

RNA-interferens i Fästingar

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Utveckling av celltyp specifika anti-HIV gp120 aptamers för siRNA leverans

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Utfodring av fästingar på djur för Transmission och Xenodiagnosis i Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nukleokapsid Annealing-medierad elektrofores (NAME) Analys Tillåter snabb identifiering av HIV-1 nukleokapsiden Hämmare

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Tillämpa ett inducerbart uttryck system att studera Störningar av bakteriell Virulensfaktorer med intracellulära signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Rening från Intracellulärt Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Små RNA transfektion i primära humana Th17 celler genom Next Generation elektroporering

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Confocal Imaging av dubbelsträngat RNA och mönster erkännande receptorer i negativ-Sense RNA-virusinfektion

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...