Name: in vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide
Uploaded: 2011-01-20T18:30:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide at JoVE.com

Le travail a été financé par NIDCD / NIH R01DC003915 à LO Bakaletz.

1. Dans la formation de biofilms in vitro <ol><li> Les colonies bactériennes (qui ont été cultivés sur gélose appropriée durant la nuit), ont été suspendues dans les médias et la DO 490 a été ajusté à 0,65 </li><li> La suspension résultante bactérienne est ensuite diluée 1:6 (1 ml de suspension bactérienne + 5 ml préchauffé moyenne) et incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant environ 3 heures pour atteindre la mi-phase log. </li><li> Diluer le 1:2500 mi-log croissance en suspension avec des pré-chauffé les médias et le lieu 200 ul de dilution dans chaque puits d&#39;une lame de chambre 8-même. </li><li> Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Après environ 16 heures, moyenne aspirer à partir du coin de chaque chambre et ajouter 200 ul frais, pré-chauffé moyen - long dispenser paroi de la chambre afin de ne pas créer des forces de cisaillement dans la chambre qui pourrait perturber le biofilm. </li><li> Si l&#39;incubation de plus de 24 heures, changement de milieu tous les 12 heures ou au besoin pour maintenir la viabilité bactérienne. </li></ol> 2. Visualisation des biofilms <ol><li> Aspirer moyennes de chaque chambre, comme décrit ci-dessus, et laver deux fois par biofilm résidents doucement avec une solution saline stérile. </li><li> Ajouter 200 ul de BacLight Live / Dead tache (3 uL composante A + 3 B composante ul par ml de solution saline) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Protéger la culture de la lumière à partir de ce point. </li><li> Aspirer la tache et laver deux fois délicatement avec une solution saline stérile comme avant. </li><li> Ajouter 200 ul du formol tamponné neutre à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer spécimen. </li><li> Retirer fixateur et éliminer correctement conformément aux directives institutionnelles. </li><li> Laver deux fois avec une solution saline et d&#39;éliminer les fluides de lavage qui contiennent du formol comme ci-dessus. </li><li> Retirez le puits en plastique de la lame, ajouter suffisamment de solution saline pour chaque puits de sorte que quand une lamelle est placée sur le joint, pas de bulles d&#39;air sont présents. </li><li> Lamelle et sceller les bords de la lamelle avec un milieu de montage. Le vernis à ongles peut être utilisée pour sceller les diapositives cependant les diapositives ne seront pas aussi permanente. </li><li> Laisser le scellant sécher pendant environ 1 heure avant d&#39;examiner par microscopie. </li></ol> 3. Résultats <img src="/files/ftp_upload/2481/2481fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentant 3D des images composites d&#39;un biofilm formé dans une chambre de diapositives 8-même. Les bactéries ont été marqués avec Live / Dead tache où des bactéries vivantes fluorescence verte et les bactéries mortes émettent une fluorescence rouge. (A) Image composite du biofilm ensemble montrant l&#39;architecture distincte avec des tours et des canaux d&#39;eau. (B) Même que dans le biofilm (A), maintenant vu en coupe transversale.

<ol>
	<li>Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms+in+otitis+media:+evidence+and+relevance.">Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance.</a> Pediatr Infect Dis J. 26, S17-S19 (2007).</li><li>Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li></ol>

Comprendre le mécanisme par lequel former des biofilms, ainsi que la caractérisation de leurs composants de la matrice, est un domaine d&#39;intérêt intense. Ce protocole peut être utilisé pour aider à identifier les protéines ou d&#39;autres constituants qui contribuent à l&#39;intégrité structurale du biofilm, ainsi que d&#39;identifier et de cibler des protéines qui peuvent se prêter à une application thérapeutique. Le temps d&#39;incubation et des dilutions dans le protocole ci-dessus décrits ont été établies pour la formation de biofilm optimale par l&#39;Haemophilus influenzae non typables (NTHi). Certains travaux préliminaires pourraient être nécessaires afin d&#39;optimiser ces étapes pour d&#39;autres espèces bactériennes (ie dilution initiale et le temps d&#39;incubation nécessaire pour atteindre la mi-log phase de croissance). La dilution 1:2500 pour l&#39;ensemencement initial des chambres a été établi pour s&#39;assurer que le biofilm robuste se développe dans la chambre de diapositives comme induite par cet organisme et dans le temps d&#39;incubation a déclaré, sans le biofilm envahit la chambre et / ou épuiser les éléments nutritifs disponibles . En conséquence, la dilution initiale et ou de temps d&#39;incubation peut être nécessaire d&#39;ajuster pour les autres espèces bactériennes.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chocolate II agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>B21267X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>8-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-656-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BacLight Live/Dead bacterial viability kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9439023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BHI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>211059</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H5533</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-NAD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N7004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permaslip mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9693613</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide

La nature chronique de nombreuses maladies est attribué à la formation de biofilms bactériens qui sont récalcitrants à l&#39;antibiothérapie classique. Les biofilms sont communautaires associés bactéries attachées à une surface et enfermé dans une matrice. Le rôle de la matrice extracellulaire est multiforme, notamment en facilitant l&#39;acquisition des nutriments, et offre une protection significative contre les stress environnementaux (réponses de l&#39;hôte, par exemple immunitaire). Dans un effort pour acquérir une meilleure compréhension de comment les bactéries dans un biofilm de répondre aux contraintes environnementales, nous avons utilisé un protocole dans lequel nous visualisons les biofilms bactériens, qui se sont formées dans une chambre de diapositives 8-même. Les biofilms ont été colorés avec du BacLight Live / Dead taches et examinés à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal pour caractériser la taille du biofilm relative, et la structure sous différentes conditions d&#39;incubation. Z-stack images ont été recueillies par microscopie confocale et analysées par COMSTAT. Ce protocole peut être utilisé pour aider à élucider le mécanisme et la cinétique par lequel former des biofilms, ainsi que d&#39;identifier les éléments qui sont importants pour la structure du biofilm et la stabilité.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide at JoVE.com

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

Cet article décrit la procédure pour la formation et la visualisation d&#39;un biofilm bactérien grandi au sein d&#39;une chambre de glisser de 8 puits

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Plaque de microtitrage biofilm essai de formation

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Entérique invasion bactérienne des cellules épithéliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Est considérablement améliorée en utilisant une chambre diffusion verticale du modèle

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l&#39; analyse biosimilarité

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

La Formation de Biofilm induite sur les sels biliaires chez les agents pathogènes entériques : Techniques d’Identification et de Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...