Name: mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00
Duration: 9 min 1 s
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Ce travail a été soutenu par K08 Prix CA116429-04 de MC et par une subvention du cancer Conquer maintenant (CONCERN) Fondation # 8501

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	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

Cet article présente un protocole de mutagenèse qui permet la génération aléatoire des grandes banques de mutants sans la nécessité pour le clonage ou la PCR. Cette méthode est basée sur erreurs de réplication d&#39;un plasmide codant pour une séquence d&#39;intérêt. En théorie, les mutations devraient être largement limités aux 100-300 pb située immédiatement en aval de l&#39;interrupteur de l&#39;ARN / ADN, la taille de leader brin intermédiaire produite par Pol I 2,10. Nous avons constaté que dans les conditions présentées dans le présent protocole, Pol mutations se produisent partout dans I le plasmide, bien que diminuant la fréquence comme la distance entre les augmentations Ori plasmide (figure 3). Cette constatation implique que la transition ou &quot;switch&quot; de Pol I Pol III pendant ColE1 réplication plasmidique est beaucoup plus progressif que celui rapporté antérieurement, au moins dans nos conditions expérimentales 2, et est d&#39;accord avec les études antérieures suggérant une redondance fonctionnelle entre Pol I et Pol III 11. Notre protocole original décrit mutagenèse dans des cultures liquides (4). Ce protocole donne 0,41 mutations / Ko pour d &lt;1000, c&#39;est à dire au sein du BP 1000 adjacent à l&#39;ADN / ARN interrupteur (tableau 1). Hypersaturation en laissant le liquide de culture dans le shaker pendant 3 jours sans l&#39;ajout de toute nouvelle presse soulève la fréquence de mutation à 0,70 mutations / ko mais les résultats de rendement plasmidique très pauvres (moins de 1% par rapport au jour 1; données non présentées) ( Tableau 1). Nous présentons ici un protocole simplifié basé sur la transformation directe plaquage de la cible plasmide sur gélose solide à 37 ° C (figure 1). Cette procédure produit la plus grande fréquence de mutation / cycle de mutagenèse (0,92 mutations / Ko pour d &lt;1000) et facilite grandement l&#39;itération. L&#39;évolution des conditions de culture d&#39;un milieu solide affecte également le spectre de mutation (tableau 2). Mutagenèse ensemencement direct réduit le asymétrie marquée entre les substitutions de paires de bases complémentaires vu en culture liquide (comparer C → T vs G → A et A → G → T vs C). D&#39;autre part, l&#39;ensemencement direct a produit plus indels (de moins de 0,5% à 4%) et diminué le nombre de mutations G → A par 3 fois, conduisant à une surreprésentation de G / C mutations (74%). Globalement, nous pensons que la plus grande simplicité et une efficacité accrue du protocole ensemencement direct présentés ici l&#39;emporte sur les avantages de la gamme un peu plus équilibrée mutation produite par mutagenèse liquide. Dans le plasmide cible, les mutations générées par notre méthode ne sont pas limités à la séquence cible souhaitée. Cependant, l&#39;évolution du roman activités biochimiques devrait dépendre de mutations dans le gène cible, car elle représente une approche qualitative plutôt que d&#39;un changement quantitatif. Ainsi, en combinant nos mutagenèse plasmide avec le dépistage de mutants sur des plaques de gradient capitalise sur les atouts de notre système (les grandes bibliothèques et de la disponibilité de la sélection) pour l&#39;évolution des nouvelles propriétés biochimiques. D&#39;autres applications de mutagenèse aléatoire telles que l&#39;optimisation des activités enzymatiques existants ou randomisant des domaines spécifiques d&#39;un gène ne nécessitent clonage suivantes mutagenèse aléatoire. Dans ce cas, disposer de la bibliothèque dans un plasmide, par opposition à un produit d&#39;amplification PCR améliore l&#39;efficacité du clonage, en facilitant l&#39;amplification et la restriction. En somme, nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutantes pour un gène cible donné qui se distingue par sa simplicité et de la diversité des bibliothèques générés. Nous montrons comment cette méthode peut être couplée avec des sélections fonctionnelles pour l&#39;évolution efficace de nouvelles activités biochimiques. En outre, notre in vivo généré les bibliothèques peuvent être facilement clonées, permettant la mutagenèse dirigée ou optimisation des activités existantes.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

La génération efficace de la diversité génétique représente un outil précieux moléculaire qui peut être utilisé pour étiqueter synthèse de l&#39;ADN, afin de créer des signatures moléculaires uniques, ou de faire évoluer les protéines dans le laboratoire. Ici, nous présentons un protocole qui permet la génération de grande taille (&gt; 10 11) banques de mutants pour une séquence cible donnée. Cette méthode est basée sur la réplication d&#39;un plasmide d&#39;encodage ColE1 la séquence désirée par une variante basse-fidélité de l&#39;ADN polymérase I (Pol LF-I). Le plasmide cible est transformé en une souche de E. mutator coli et étalées sur un milieu solide, ce qui donne entre 0,2 et 1 mutations / ko, en fonction de la localisation du gène cible. Fréquences de mutation plus élevés sont obtenus par itération de ce processus de mutagenèse. Comparé à d&#39;autres méthodes de mutagenèse, notre protocole se distingue par sa simplicité, comme le clonage ou la PCR ne sont impliqués. Ainsi, notre méthode est idéale pour l&#39;étiquetage mutationnel de plasmides ou autres modèles, je Pol ou à explorer une grande partie de l&#39;espace de séquence pour l&#39;évolution des activités non présentes dans la cible originale. Le contrôle serré spatiale que la PCR ou randomisé à base d&#39;oligonucléotides offrent des méthodes peuvent aussi être atteints par clonage ultérieur des sections spécifiques de la bibliothèque. Ici nous fournir des protocoles montrant comment créer une bibliothèque aléatoire de mutants et comment établir des médicaments à base des sélections dans E. coli afin d&#39;identifier des mutants présentant de nouvelles activités biochimiques.

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Ici nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutant pour une séquence cible donnée. Nous montrons comment cette méthode, qui est réalisée in vivo chez Escherichia coli, peuvent être couplées avec des sélections fonctionnelles d&#39;évoluer de nouvelles activités enzymatiques.

Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l&#39;évolution dirigée de protéines dans les E. coli</em

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