Name: mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס CA116429 K08-04 ל MC ועל ידי מענק מטעם סרטן לכבוש את עכשיו (הנוגעים) תשתית # 8501

<ol>
	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מאמר זה מציג פרוטוקול mutagenesis המאפשר את הדור של ספריות גדולות מוטציה אקראית ללא צורך בשיבוט או PCR. שיטה זו מבוססת על שכפול וטעייה מועדים של קידוד פלסמיד רצף של עניין. בתיאוריה, מוטציות יש להגביל במידה רבה 100-300 נ&quot;ב ממוקם מיד במורד הזרם של הבורר RNA / DNA, בגודל של מנהיג גדיל ביניים הופק על ידי פול אני 2,10. מצאנו כי בתנאים שהוצגו פרוטוקול זה, פול מוטציות אני להתרחש בכל רחבי הפלסמיד, אם כי בתדירות הולכת ופוחתת ככל המרחק גדל פלסמיד אורי (איור 3). ממצא זה מרמז כי המעבר או &quot;הבורר&quot; של פול אני אל Pol III במהלך שכפול ColE1 פלסמיד הוא הרבה יותר הדרגתית מאשר שדווח קודם לכן, לפחות בתנאי הניסוי שלנו 2, ומסכים עם מחקרים קודמים מציע יתירות פונקציונלית בין Pol Pol ו אני III 11. הפרוטוקול המקורי שלנו תיאר mutagenesis בתרבויות נוזלי (4). פרוטוקול זה מניב 0.41 מוטציות / kb עבור d &lt;1000, כלומר בתוך 1000 bp סמוך RNA / DNA מתג (טבלה 1). Hypersaturation ידי עזיבת תרבות נוזל בתוך שייקר במשך 3 ימים ללא תוספת של כל מדיה טרי מעלה את שכיחות המוטציה על 0.70 מוטציות / kb אבל התוצאה היא תשואה פלסמיד עני מאוד (פחות מ -1% לעומת יום 1; מידע לא מוצג) ( טבלה 1). כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על ציפוי ישירות את הטרנספורמציה של יעד פלסמיד על אגר מוצק ב 37 ° C (איור 1). פרוצדורה זו מייצרת את תדר הגדול ביותר של מוטציה / מעגל mutagenesis (0.92 מוטציות / kb עבור d &lt;1000) ו מאוד מקל איטרציה. שינוי התנאים תרבות התקשורת מוצק משפיע גם על ספקטרום מוטציה (טבלה 2). Mutagenesis ציפוי ישיר מפחית סימנה את האסימטריה בין משלים צמד החלפות בסיס לראות תרבות נוזלי (להשוות C → T לעומת G → ​​A ו-G מול → T → C). מצד שני, ציפוי ישיר מיוצר indels יותר (0.5% פחות מאשר 4%) וירידה במספר מוטציות G → ​​ידי 3-לקפל, המובילה לייצוג יתר של G / C מוטציות (74%). בסך הכל, אנו מאמינים כי פשטות ויעילות מוגברת של פרוטוקול ציפוי ישיר שהוצגו כאן עולה על היתרונות של ספקטרום מוטציה מעט מאוזן יותר המיוצר על ידי mutagenesis נוזלי. במגבלת היעד של פלסמיד, מוטציות הנוצר על ידי השיטה שלנו לא מוגבלים רצף היעד הרצוי. עם זאת, ההתפתחות של פעילויות ביוכימיות רומן צריך להיות תלוי מוטציות בתוך הגן היעד, שכן היא מייצגת איכותי ולא שינוי כמותי. לפיכך, שילוב mutagenesis הפלסמיד שלנו עם הקרנה של מוטציות על צלחות שיפוע מנצל את היתרונות של המערכת שלנו (ספריות גדולות וזמינות של מבחר) לאבולוציה של מאפיינים ביוכימיים חדשים. יישומים אחרים של mutagenesis אקראי כגון אופטימיזציה של הפעילות האנזימטית קיימים או אקראי אזורים ספציפיים של גן דורשים שיבוט הבאים mutagenesis אקראי. במקרה זה, בעל ספריה הפלסמיד לעומת מוצר הגברה PCR משפר את יעילות שיבוט ידי הקלת הגברה הגבלה. לסיכום, אנחנו מדגימים את פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית עבור גן מטרה בהתחשב בעובדה בולטת בפשטותה לגיוון של ספריות שנוצר. אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להיות יחד עם בחירות פונקציונלי לאבולוציה יעיל של פעילויות ביוכימיות חדש. בנוסף, שלנו vivo שנוצר ספריות ניתן לשכפל בקלות, ומאפשר לאתר ספציפי mutagenesis או אופטימיזציה של הפעילות הקיימת.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

הדור יעיל של המגוון הגנטי מייצג כלי מולקולרית יסולא בפז כי ניתן להשתמש בתווית סינתזה של DNA, כדי ליצור חתימות מולקולרי ייחודי, או להתפתח חלבונים במעבדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר דור (&gt; 10 11) ספריות גדולות מוטציה עבור רצף יעד נתון. שיטה זו מבוססת על שכפול של קידוד ColE1 פלסמיד רצף הרצוי על ידי גרסה נמוכה נאמנות של פולימראז ה-DNA אני (LF-Pol אני). היעד פלסמיד הופכת זן המוטטורי של E. coli ו מצופה על התקשורת מוצק, מניב בין 0.2 ל 1 מוטציות / kb, בהתאם למיקום של גן המטרה. תדרים מוטציה גבוהה מושגות על ידי iterating תהליך זה של mutagenesis. בהשוואה לשיטות חלופיות mutagenesis, פרוטוקול שלנו בולטת בפשטותה, שכן לא שיבוט PCR או מעורבים. לכן, השיטה שלנו הוא אידיאלי עבור תיוג מוטאציות של פלסמידים או אחרת אני תבניות פול או לחקור חלקים גדולים של מרחב רצף לאבולוציה של פעילויות לא נוכח היעד המקורי. השליטה במרחב הדוק כי PCR או להציע אקראי oligonucleotide שיטות המבוססות יכול גם להיות מושגת באמצעות שיבוט הבאות של חלקים מסוימים של הספרייה. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מראה כיצד ליצור ספריה מוטציה אקראית וכיצד להקים התרופה מבוססת בחירות E. coli כדי לזהות מוטציות מציג פעילויות ביוכימיות חדש.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli at JoVE.com

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...