Name: mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00
Duration: 9 min 1 s
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	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

この記事では、クローニングまたはPCRを必要とせずに大規模なランダム変異体ライブラリーの生成を可能にする突然変異誘発プロトコールを示します。このメソッドは、コードするプラスミド目的の配列のエラーが発生しやすいのレプリケーションに基づいています。理論的には、突然変異の大部分はRNA / DNAスイッチのすぐ下流に位置する100から300 bpに制限しなければならない、リーダー鎖の中間の大きさは、ポル私2,10によって生産。我々は、プラスミドのoriが増加する（図3）からの距離と周波数の減少が、このプロトコルで提示条件の下で、ポル私の変異は、すべてのプラスミド上で発生することがわかった。この知見は、転移やColE1プラスミド複製中にはPol IIIにはPol Iから&quot;スイッチが&quot;少なくとも我々の実験条件2の下に、はるかに緩やかな以前の報告よりであることを意味し、そしてポル私とポルとの間の機能的な冗長性を示唆する以前の研究と一致III 11。 当社独自のプロトコルでは、液体培養（4）に変異を説明。このプロトコルは、RNA / DNAスイッチ（表1）に隣接する1000塩基の中で、すなわち、D &lt;1000 0.41突然変異/ kbを得られます。どんな新鮮な培地を添加せずに3日間振盪機で液体培養を残すことHypersaturationは0.70突然変異/ kbに、非常に貧しいプラスミド収量の結果（1％未満1日目と比較すると、データは示していない）への変異頻度を発生させます（表1）。ここでは、直接37 ° C（図1）における固体寒天上で目的プラスミドの形質転換をめっきに基づいて簡易プロトコルを提示する。この手順では、変異誘発の突然変異/サイクル（0.92突然変異/ D &lt;1000 KB）の最大周波数を生成し、非常に反復を容易にします。固体培地に培養条件を変更すると、突然変異のスペクトル（表2）に影響します。ダイレクトメッキの突然変異誘発は、マークは（C→T対G→AとA→GとT→Cを比較）液体培地で見られる相補的塩基対の置換の間に非対称性が減少。一方、直接めっきはより多くのindelsの（0.5％未満から4％へ）生産され、3倍で→G変異の数を減少し、G / Cの変異（74％）のoverrepresentationにつながる。全体的に、我々はここで紹介するダイレクトプレーティングプロトコルのより簡潔さと効率性の向上が液体変異導入により生成少しよりバランスのとれた突然変異スペクトルのメリットを上回ると信じています。 プラスミドターゲット内に、私たちのメソッドによって生成される変異が所望の標的配列に限定されるものではない。それは定性的ではなく定量的な変化を表しているしかし、小説生化学的活動の進化は、標的遺伝子内の変異に依存する必要があります。従って、勾配プレート上の変異体のスクリーニングとのプラスミド変異を組み合わせることで新たな生化学的性質の進化のための私たちのシステム（大規模なライブラリや選択の可用性）の強みを利用しています。このような既存の酵素活性の最適化や遺伝子の特定の領域をランダム化するようなランダム変異誘発の他のアプリケーションでは、ランダム変異誘発は、次のクローニングを必要としません。この場合、PCRの増幅産物とは対照的に、プラスミドでライブラリを持つことは、増幅し、制限を容易にすることにより、クローニングの効率を向上させます。 要するに、我々は、そのシンプルさのために、生成されたライブラリの多様性のため目立つ所定の標的遺伝子のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、このメソッドは新しい生化学的活動の効率的な発展のための機能的な選択と結合することができる方法を示します。さらに、私たちは、 生体内で生成されたライブラリ内の既存の活動の部位特異的変異誘発または最適化を可能に、容易にクローニングすることができる。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

遺伝的多様性の効率的な世代は、ユニークな分子の署名を作成するために、または実験室での蛋白質を進化させ、DNA合成のラベル付けに使用することができる貴重な分子ツールを表します。ここでは、特定の標的配列のための大規模な（&gt; 10 11）変異体ライブラリーの生成を可能にするプロトコルを示す。このメソッドは、DNAポリメラーゼI（LF -ポルI）の低忠実度の変異によってColE1プラスミドエンコーディングの複製所望の配列に基づいています。目的プラスミドは、E.のミューテーター株に変換されます大腸菌と固形培地上にプレーティングは、標的遺伝子の位置に応じて、0.2と1の変異/ KBの間得た。より高い突然変異の頻度は、突然変異誘発のこのプロセスを繰り返すことにより達成されています。変異導入の代替方法と比較して、我々のプロトコルは、クローニングまたはPCRが含まれないとして、そのシンプルさで際立っている。このように、私たちの方法は、変異プラスミドまたは他のポル私のテンプレートのラベルまたは元のターゲットには存在しない活動の発展のためにシーケンス空間の大部分を探索するために理想的です。 PCRやランダムオリゴヌクレオチドベースの手法の提案も、ライブラリの特定のセクションのその後のクローニングによって達成できることをタイトな空間的な制御。ここでは、ランダム変異体ライブラリーを作成する方法とE.の薬剤ベースの選択を確立する方法を示すプロトコルを提供する新しい生化学的な活動を示す変異体を同定するために大腸菌 。

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

ここでは、特定の標的配列のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、大腸菌の中で、生体内で行われるこの方法は、、新たな酵素活性を進化させ、機能の選択と結合することができる方法を示します。

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