Name: mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00
Duration: 9 min 1 s
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이 작품은 수상 K08 MC로 CA116429 - 04과 지금 정복 암에서 부여 (우려) 기초 # 8501에 의해 지원되었습니다

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	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서는 복제 또는 PCR에 대한 필요없이 대규모 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 플라스미드 인코딩 관심 일련의 오류가 자주 발생하는 복제를 기반으로합니다. 이론적으로, 돌연변이 크게 RNA / DNA 스위치의 바로 하류에 위치한 100-300 BP로 제한되어야 리더 스트랜드 중간의 크기는 폴 I 2,10에 의해 생산. 우리는 플라스미드 오라이 증가 (그림 3)에서 거리로 주파수에 떨어지지만이 프로토콜에서 제시한 조건 하에서, 폴 I의 변이가 모든 플라스미드를 통해 발생하는 것으로 나타났습니다. 이 발견은 전환 또는 ColE1 플라스미드 복제하는 동안 폴 III에 폴 I에서 &quot;스위치가&quot;최소한의 실험 조건이에서 훨씬 더 점진적으로 이전에 보고된 것보다 것을 의미하고, 폴 I와 폴 사이의 기능 중복을 제안 이전의 연구에 동의 III 11. 우리의 원래의 프로토콜은 액체 문화 (4)에서 돌연변이 유발을 설명했다. 이 프로토콜은 RNA / DNA 스위치 (표 1)에 인접한 1000 BP 내에 0.41 돌연변 / D &lt;1000, IE 용 킬로바이트를 산출. 어떤 신선한 매체의 추가없이 3 일간 통에 액체 문화를 떠나는하여 Hypersaturation은 0.70 변이 / 킬로바이트하지만 매우 가난 플라스미드 수율 결과 (1 % 미만 1 일에 비해, 데이터는 표시되지 않음)에 돌연변이 주파수를 올립니다 ( 표 1). 여기에 우리가 직접 37 단단한 한천에 플라스미드 대상의 변환 도금을 기반으로 단순화된 프로토콜을 제시 ° C (그림 1). 이 절차는 돌연변이 유발의 돌연변이 /주기 (0.92 돌연변 / D &lt;1000 KB)의 가장 큰 빈도를 생산 크게 반복을 용이하게합니다. 고체 미디어 문화 조건을 변경하면 변이 스펙트럼 (표 2)에 영향을 미칩니다. 직접 도금 돌연변이 유발이 표시는 (C → T 대 G → A와 → G → C T 대 비교) 액체 문화에서 볼 보완 기지 페어 대체 간의 이러한 비대칭성 감소시킵니다. 한편, 직접 도금 더 indels을 (이하 0.5 % 4 %에서) 생산 및 G / C 돌연변이 (74 %)의 overrepresentation로 이어지는 3 배로 → G 변이의 수를 감소. 전반적으로, 우리는 여기 제시 직접 도금 프로토콜의보다 단순 성과 효율성 향상 액체 돌연변이 유발에 의해 만들어진 약간 더 균형 돌연변이 스펙트럼의 장점을 능가 있다고 생각합니다. 플라스미드 대상 내에서 우리의 방법에 의해 생성되는 돌연변이가 원하는 대상 순서로 제한되지 않습니다. 그것이 오히려 양적 변화보다는 질적을 나타냅니다 그러나, 소설 생화학 활동의 발전, 목표 유전자 내에 돌연변이에 의존해야합니다. 따라서, 기울기 접시에 돌연변이 선별과 함께 플라스미드 돌연변이 유발을 결합하는 새로운 생화 학적 속성의 진화를위한 시스템 (대형 라이브러리와 선택의 가용성)의 장점에 capitalizes. 이러한 기존의 효소 활동을 최적화하거나 유전자의 특정 영역을 randomizing 등 무작위로 돌연변이 유발의 다른 응용 프로그램이 임의의 돌연변이 유발 다음 복제를 사용해야합니다. 이 경우에는, PCR의 증폭 제품 반대로 플라스미드의 도서관 것은 증폭 및 제한을 용이하게하여 복제의 효율성을 향상시킵니다. 요컨대, 우리는 단순과 생성된 라이브러리의 다양성을 위해 의미 주어진 대상 유전자의 무작위 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는이 방법이 새로운 생화 학적 활동의 효율적인 진화를위한 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리의 생체내 생성된 라이브러리는 기존 활동의 사이트에 특정 돌연변이 유발 또는 최적화를 허용, 쉽게 복제하실 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

유전자 다양성의 효율적인 세대는 DNA 합성을 레이블에 고유한 분자 서명을 만들거나 실험실에서 단백질을 진화하는 데 사용할 수있는 귀중한 분자 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 주어진 대상 시퀀스 대형 (&gt; 10 11) 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 DNA의 중합 효소의 낮은 충실도 변형하여 ColE1 플라스미드 인코딩 원하는 순서의 복제 I (LF - 뽈 I)을 기반으로합니다. 플라스미드 대상은 E.의 mutator 변형으로 변화됩니다 대상 유전자의 위치에 따라 0.2, 1 변이 / 킬로바이트 사이 항복 대장균 및 고체 미디어에 도금. 높은 돌연변이 주파수는 돌연변이 유발의 과정을 iterating하여 얻을 수 있습니다. 더 복제 또는 PCR에 참여하지 않습니다과 같은 돌연변이 유발의 다른 방법에 비해, 우리의 프로토콜은 그 단순을 위해 의미합니다. 따라서, 우리의 방법은 mutational plasmids 또는 기타 폴 I 템플릿의 라벨 또는 원래의 대상에 존재하지 않는 활동의 진화에 대한 순서 공간 큰 부분을 탐험에 이상적입니다. PCR 또는 무작위 oligonucleotide 기반 방법을 제공은 또한 라이브러리의 특정 섹션의 후속 복제를 통해 얻을 수있는 꽉 공간을 제어합니다. 여기서 우리는 임의의 돌연변이 라이브러리를 만드는 방법을 보여주는 프로토콜을 제공하고 E.에서 마약을 기반으로 선택을 설정하는 방법 새로운 생화 학적 활동을 전시 돌연변이를 식별하는 대장균.

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

연구

생물학

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

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Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...