Name: mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00
Duration: 9 min 1 s
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Este trabajo ha sido financiado por el premio K08 CA116429-04 en MC y por una beca de la Conquista del Cáncer Ahora (preocupación) base 8501 #

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	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

En este artículo se presenta un protocolo de mutagénesis que permite la generación de grandes bibliotecas de mutantes al azar sin la necesidad de que la clonación o la PCR. Este método se basa en propenso a errores de replicación de un plásmido que codifica una secuencia de interés. En teoría, las mutaciones se debe en gran parte limitada a los 100 a 300 pb situado inmediatamente aguas abajo del interruptor de ADN / ARN, el tamaño de la cadena líder intermedios producidos por Pol I 2,10. Hemos encontrado que en las condiciones se presentan en este protocolo, Pol mutaciones que ocurren en todo el plásmido, a pesar de la disminución en la frecuencia como la distancia a partir del plásmido aumenta ori (Figura 3). Este hallazgo implica que la transición o &quot;switch&quot; de Pol I Pol III durante la replicación del plásmido ColE1 es mucho más gradual que se informó anteriormente, por lo menos bajo condiciones experimentales dos, y está de acuerdo con estudios anteriores que sugiere una redundancia funcional entre I y Pol Pol III 11. El protocolo original describe mutagénesis en cultivos líquidos (4). Este protocolo rendimientos 0,41 mutaciones / kb para d &lt;1000, es decir, dentro de los 1000 pb al lado del ADN / ARN interruptor (Tabla 1). Hypersaturation dejando el cultivo líquido en el agitador durante 3 días sin la adición de nuevos medios de comunicación aumenta la frecuencia de mutación de 0,70 mutaciones / kb, pero los resultados en el rendimiento de plásmido muy pobres (menos del 1% en comparación con el día 1; datos no mostrados) ( Tabla 1). Aquí se presenta un protocolo simplificado basado en placas directamente la transformación de la meta del plásmido en agar sólido a 37 ° C (Figura 1). Este procedimiento produce la mayor frecuencia de mutación / ciclo de mutagénesis (0,92 mutaciones / kb para d &lt;1,000) y facilita la iteración. Cambiar las condiciones de cultivo para los medios sólidos también afecta a la mutación del espectro (Tabla 2). Mutagénesis siembra directa reduce la marcada asimetría entre los pares de bases complementarias sustituciones visto en cultivo líquido (compare C → T vs G → A y A → G vs T → C). Por otro lado, la siembra directa produce más indeles (de menos de 0,5% a 4%) y disminuyó el número de mutaciones A → G por tres veces, dando lugar a una sobrerrepresentación de G / C mutaciones (74%). En general, creemos que la mayor simplicidad y una mayor eficiencia del protocolo de siembra directa que aquí se presenta mayor que los beneficios de la mutación del espectro un poco más equilibrada producida por mutagénesis líquido. Dentro del objetivo de plásmido, las mutaciones generadas por nuestro método no se limitan a la secuencia de destino deseado. Sin embargo, la evolución de la novela de las actividades bioquímicas debe depender de las mutaciones en el gen de interés, ya que representa un salto cualitativo en lugar de un cambio cuantitativo. Por lo tanto, la combinación de nuestra mutagénesis plásmido con la detección de mutantes en las placas de gradiente aprovecha los puntos fuertes de nuestro sistema (las grandes bibliotecas, y la disponibilidad de la selección) para el desarrollo de nuevas propiedades bioquímicas. Otras aplicaciones de la mutagénesis al azar, tales como la optimización de las actuales actividades enzimáticas o asignaron al azar a las áreas específicas de un gen requieren clonación siguientes mutagénesis aleatoria. En este caso, tener la biblioteca en un plásmido en comparación con un producto de amplificación por PCR mejora la eficiencia de la clonación, al facilitar la amplificación y restricción. En resumen, hemos demostrado un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de un gen diana, ya que destaca por su sencillez y por la diversidad de las bibliotecas generado. Se muestra cómo este método puede ser, junto con las selecciones funcionales para la evolución eficiente de las nuevas actividades bioquímicas. Además, nuestro in vivo generados por las bibliotecas pueden ser fácilmente clonadas, lo que permite mutagénesis sitio-específica o la optimización de las actividades existentes.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

La generación eficiente de la diversidad genética representa una valiosa herramienta molecular que puede ser utilizada para etiquetar la síntesis de ADN, para crear los patrones moleculares, o para desarrollar las proteínas en el laboratorio. A continuación, presentamos un protocolo que permite la generación de gran tamaño (&gt; 10 11) bibliotecas de mutantes en una secuencia objetivo determinado. Este método se basa en la replicación de un plásmido ColE1 codificación de la secuencia deseada por una variante de baja fidelidad de la DNA polimerasa I (LF-Pol I). El objetivo del plásmido se transforma en una cepa de E. mutador coli y siembra en medio sólido, que oscilan entre un 0,2 y un mutaciones / kb, dependiendo de la localización del gen objetivo. Mayores frecuencias de mutación se logran mediante la iteración de este proceso de mutagénesis. En comparación con otros métodos de mutagénesis, el protocolo se destaca por su sencillez, como la clonación o la PCR no están involucrados. Por lo tanto, nuestro método es ideal para el etiquetado de las mutaciones de los plásmidos u otras plantillas que Pol o para explorar una gran parte del espacio de secuencias de la evolución de las actividades que no están presentes en la meta original. El estricto control espacial que la PCR o al azar oligonucleótidos basados ​​en ofrecer métodos también se puede lograr a través de la posterior clonación de las secciones específicas de la biblioteca. Aquí les ofrecemos los protocolos que muestra cómo crear una biblioteca de mutantes al azar y la forma de establecer las drogas basadas en las selecciones de E. coli para identificar mutantes presentan nuevas actividades bioquímicas.

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Aquí se demuestra un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de una secuencia objetivo determinado. Se muestra cómo este método, que se realiza en vivo en Escherichia coli, se pueden acoplar con la selección funcional para desarrollar nuevas actividades enzimáticas.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

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