Name: mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli at JoVE.com

Bu çalışma, K08 ödül CA116429-04 MC&#39;ye ve Şimdi Conquer Kanser hibe (endişe) temel # 8501 tarafından desteklenen

<ol>
	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

Bu makale, klonlama veya PCR için gerek kalmadan büyük rastgele mutant kütüphanelerinin oluşturulmasına imkan mutagenez protokol sunar. Bu yöntem bir plazmid kodlama ilgi bir dizi hata eğilimli çoğaltma dayanmaktadır. Teoride, mutasyonların büyük ölçüde RNA / DNA anahtarı hemen akış aşağısında bulunan 100-300 bp sınırlı olmalıdır lideri iplikçik ara boyutunu ben 2,10 Pol tarafından üretilen. Plazmid ori artar (Şekil 3) uzaklık olarak sıklığı azalan ancak bu protokol sunulan koşullar altında, Pol I mutasyonların, tüm plazmid üzerinde meydana geldiği bulundu. Bu bulgu, geçiş veya ColE1 plazmid çoğaltma sırasında Pol III Pol I &quot;anahtarı&quot; en azından bizim deneysel koşulları 2 altında, daha önce rapor edilenden çok daha tedrici olduğunu ima eder ve Pol I ve Pol arasında işlevsel bir fazlalık gösteren daha önceki çalışmaların kabul eder III 11. Bizim orijinal protokol sıvı kültürleri (4) mutagenez nitelendirdi. Bu protokol, RNA / DNA anahtarı (Tablo 1) bitişik 1000 bp içinde 0.41 mutasyonlar / d &lt;1000, yani kb verir. Herhangi bir yeni medya katkısı olmadan 3 gün boyunca çalkalayıcı sıvı kültürü bırakarak Hypersaturation 0.70 mutasyonlar kb / ama sonuç çok kötü plazmid verim (% 1&#39;den daha az 1 gün ile karşılaştırıldığında; veriler gösterilmemiştir) mutasyon sıklığı yükseltir ( Tablo 1). Burada doğrudan 37 katı agar plazmid hedef dönüşümü kaplama dayalı basitleştirilmiş bir protokol mevcut ° C (Şekil 1). Bu prosedür mutagenez mutasyon / döngüsü (0.92 mutasyonlar / d &lt;1000 kb) en büyük frekans üretir ve büyük ölçüde iterasyon kolaylaştırır. Katı ortam kültürü değişen koşullara da mutasyon spektrumu (Tablo 2) etkiler. Doğrudan kaplama mutagenez işaretli (karşılaştırmak C → T vs G → A ve A → G vs T → C) sıvı kültüründe görülen tamamlayıcı baz çifti oyuncu değişikliği arasındaki asimetri azaltır. Öte yandan, doğrudan kaplama daha fazla indels (% 0,5 &#39;den az% 4 dan itibaren) üretilen ve G / C mutasyonlar (% 74) bir overrepresentation yol, 3-kat A → G mutasyonların sayısı azalmış. Genel olarak, burada sunulan doğrudan kaplama protokol daha fazla basitlik ve verimlilik artışı sıvı mutagenez tarafından üretilen biraz daha dengeli bir mutasyon yelpazenin faydaları daha ağır basar inanıyoruz. Plazmid hedef içinde, bizim yöntemi ile üretilen mutasyonlar istenen hedef dizisine sınırlı değildir. Ancak, evrim roman biyokimyasal faaliyetlerin nicel bir değişiklik daha ziyade niteliksel bir temsil olarak, hedef gen içinde mutasyonlar bağımlı olmalıdır. Böylece, degrade plakalar üzerinde mutantlar tarama ile plazmid mutagenez birleştirerek, yeni bir biyokimyasal özellikleri evrim için sistem (büyük kütüphaneler ve seçim durumu) güçlü istifade. Diğer uygulamalar mevcut enzimatik faaliyetleri optimize etmek veya bir genin belirli alanlarda rastgele rastgele mutagenez rastgele mutagenez aşağıdaki klonlama gerektirir. Bu durumda, bir PCR ürünü aksine bir plazmid kütüphane, amplifikasyon ve kısıtlama kolaylaştırarak klonlama verimliliğini artırır. Özetle, biz, sadeliği ve oluşturulan kütüphaneler çeşitliliğine sıyrılıyor belirli bir hedef gen için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Biz bu yöntem, yeni bir biyokimyasal faaliyetlerin verimli evrim için fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, bizim in vivo oluşturulan kütüphaneler, mevcut faaliyetleri siteye özgü mutagenez veya optimizasyon sağlayan, kolay klonlanmış olabilir .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

Genetik çeşitliliğin verimli üretimi, DNA sentezi etiketlemek için tek bir moleküler imza oluşturmak için, ya da laboratuvarda proteinleri gelişmeye kullanılabilir, paha biçilmez bir moleküler aracı temsil eder. Burada, belirli bir hedef dizisi için büyük (&gt; 10 11) mutant kütüphaneler üretimi sağlayan bir protokol mevcut. Bu yöntem ColE1 plazmid DNA polimeraz düşük bir sadakat varyant bir kodlama istenen sırada çoğaltma I (LF-Pol I) dayanmaktadır. Plazmid hedef E. Mutator gerginlik dönüştü. , hedef gen konuma bağlı olarak 0.2 ve 1 mutasyonları / kb arasında verimli coli ve kaplama, katı ortam . Yüksek mutasyon mutagenez bu süreci yineleme frekansları elde edilir. Hiçbir klonlama veya PCR katılan mutagenez alternatif yöntemler ile karşılaştırıldığında, bizim protokol, sadeliği göze çarpıyor. Böylece, yöntem, plazmid ya da diğer Pol I şablonları mutasyon etiketlenmesi ya da orijinal hedef mevcut faaliyetlerinin gelişimi için sırasını alan büyük bölümlerini keşfetmek için ideal. PCR veya randomize oligonükleotid tabanlı yöntemler teklif de kütüphanede belirli bölümlerini sonraki klonlama yoluyla elde edilebilir sıkı mekansal kontrolü. Burada, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için nasıl gösteren protokolleri sağlamak ve E. ilaç tabanlı seçimleri nasıl kurmak için yeni biyokimyasal faaliyetler sergileyen mutantlar tanımlamak için coli.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli at JoVE.com

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biyoloji

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...