Name: high-efficiency transduction of liver cancer cells by recombinant adeno-associated virus serotype 3 vectors
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors at JoVE.com

نشكر الدكاترة. ر وجود Samulski شياو شياو للهدايا من نوعها AAV3 المؤتلف والبلازميدات AAV - EGFP ، على التوالي ، والدكتور توملينسون غيل بسخاء لتوفير خلايا Hep293TT. وأيد هذا البحث في جزء من دائرة الصحة العامة R01 المنح منحة HL - 076901 ، 097088 HL - R01 ، وP01 DK - 058327 (المشروع 1) من المعاهد الوطنية للصحة (ك).

1. التعبئة والتغليف من المؤتلف المصلي غدة الفيروسات المرتبطة 3 (rAAV3) المتجهات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الموقع : &quot; <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> &quot;وحساب كمية من الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل مزيج البلازميدات pHelper (مساعد اتش) ، pACG2c3 (AAV المساعد) وpdsAAV - CB - EGFP (rAAV ناقلات) في المتوسط ​​دون FBS والمضادات الحيوية. وينبغي أن يكون مجموع حجم ميكرولتر 8750 لمدة عشر لوحات 15 سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة إضافة ميكرولتر من 1250 PEI (0.1 ٪ M / V ، Polysciences ، القط # 23966 ، ودرجة الحموضة 4.5) في الحمض النووي في حل الخطوة 1.2. دوامة الحل PEI الحمض النووي لبضع ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان DNA - PEI حل لتشكيل مجمع لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الحمض النووي PEI حل بنسبة 15 صفيحة 2 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة بعد 4 ساعات ، مع استبدال الطازجة المتوسطة 25 مل كاملة +10 ٪ FBS (C - DMEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنتين وسبعين ساعة بعد ترنسفكأيشن ، وخلايا كشط وتصب في انبوب مخروطي سعة 250 مل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 3000 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تخلصي طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلية بيليه في 5 مل من الميزانية العادية TMS العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 150 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0). نقل إلى أنبوب جديد 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد حمام الجليد الجاف الايثانول لمدة 10 دقيقة ، وذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. كرر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من MgCl 4.8 M 2 و 2 ميكرولتر من Benzonase (25 U / ميكرولتر ، Novagen ، القط # 70664-3). دوامة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 4000 دورة في الدقيقة ، في 4 لمدة 40 دقيقة درجة مئوية وجمع طاف (توضيح lysate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 13 مل الطرد المركزي السريعة الختم (بيكمان ، القط # 342413) ، تحميل iodixanol التدرج (OptiPrep ، القط # 1114542) من أعلى إلى أسفل : 2 مل من 15 ٪ ، و 2 مل من 25 ٪ ، و 1.5 مل من 40 ٪ و 1.5 مل من iodixanol 60 ٪. تحميل طاف (الخطوة 1.12) على رأس التدرج iodixanol. ملء الأنابيب العازلة مع TMS RB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 75000 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 16 درجة مئوية باستخدام بيكمان 90Ti الدوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكسر iodixanol 40 ٪ عن طريق إدخال حقنة في حدود 40-60 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جزء iodixanol 40 ٪ في أنبوب واحد 50 مل المخروطية وجعل ما يصل الى 40 مل مع الاحتياطي A (20 ملي تريس ، 15 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز التنقية باستخدام HiTrap س HP العمود (جنرال الكتريك للرعاية الصحية ، القط 17-1154-01 #). غسل العمود مع العازلة التالية : 25 مل من الاحتياطي A (20 ملي تريس ، 15 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) ؛ و 25 مل من الاحتياطي ب (10 ملي تريس ، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) و 50 مل من الاحتياطي A 40 مل من عينة الفيروس في الاحتياطي A و 50 مل من الاحتياطي A (20 ملي تريس ، 15 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) ؛ و 20 مل من الاحتياطي C (20 ملي تريس ، 175 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع C العازلة في المكثفات أبولو 20 مل (المداري العلوم البيولوجية). الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل والتدفق من خلال إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني والمبردة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة ، في 4 لمدة 10 دقيقة درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل والتدفق من خلال إضافة 500 ميكروليتر من PBS مبردة. غسل ناقلات الخروج من الغشاء ونقلها إلى أنابيب إيبندورف سيليكون المعاملة والمجمدة في مخزن صغير في aliquots -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. تصميم التتر ناقل rAAV3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب 10 ميكرولتر من تنقية الفيروس في أنبوب إيبندورف على الجليد. إضافة 40 ميكرولتر من DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.2 ميكرولتر من Benzonase (25 U / ميكرولتر ، Novagen ، القط # 70664) ، ويحضن في 37 ساعة : 1 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ميكرولتر من اتخاذ معيار البلازميد (0.2 نانوغرام / ميكرولتر) في أنبوب آخر إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 100 ملم في كل أنبوب واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد على الجليد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غشاء نقل (ميليبور ، القط # INYC00010) وفقا لمرشح ورقة بيو دوت (بيو راد ، القط # 1620161). شطف الغشاء في SSC 10X مع ثلاثة أوراق الترشيح لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين فتحة لطخة SF جهاز (بيو دوت ، القط # 170-6542). الاتصال قارورة فراغ وإضافة 100 ميكرولتر من SSC 10X لطخة جهاز الفتحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 20X SSC و 1 ميكرولتر صبغة تحميل 6X إلى كل من العينات في الخطوة 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 100 ميكرولتر من كل العينات على الغشاء في الفتحة جهاز صمة عار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة آخر ميكرولتر 100 من SSC 10X في كل من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.9 و 2.10 حتى كل عينة يمر عبر الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك الجهاز وإزالة لطخة فتحة الغشاء. وضعه في رابط المفتش SL - 1000 Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. بدوره على &quot;الطاقة&quot; ، &quot;تشعبي الأمثل&quot; (عرض 1200) ، ودفع &quot;ابدأ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي 1 مل من السائل المنوي السلمون (SS) DNA (فيشر ، القط # NC9753983) لمدة 5 دقائق. البرد على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل قبل التهجين عن طريق خلط 27.5 مل من DDH 2 O ، 15 مل من 20X SSC ، 5 مل من محلول 50x دينهارت و1.25 مل من SDS 20 ٪ ، 0.25 مل من PolyA و 1 مل من الحمض النووي من الخطوة SS 2.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الغشاء في 25 مل من محلول قبل التهجين في اسطوانة زجاجية وتوج احتضان عند 65 درجة مئوية في غرفة التهجين بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 50 نانوغرام قوالب الحمض النووي في 10 ميكرولتر من DDH 2 O. يغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الجليد والبرد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة في لRT 1 دقيقة. إضافة 2 ميكرولتر من dNTPs مم 3 10 (تفتقر dCTP) ، و 2 ميكرولتر من Hexanucleotide ميكس (روش ، القط # 11277081001) ، 1 ميكرولتر من Klenow (روش ، القط # 11008404001) و 5 ميكرولتر من α -32 ف dCTP. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي G - 50 أعمدة (GE للرعاية الصحية ، القط # 27-5330-01) في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تحميل التحقيق في الخطوة 2.17 في العمود. الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة وجمع من خلال تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد الإشعاعي. تغلي التحقيق في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الجليد والبرد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة لجنة التحقيق (6x10 5 نسخة في الدقيقة / مل) في حل ما قبل التهجين مع الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن بين عشية وضحاها على 65 درجة مئوية في غرفة التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حل التهجين وشطف الغشاء في 2X SSC SDS +0.1 ٪ على RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل وشطف الغشاء في 0.1x SSC SDS +0.1 ٪ عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل وشطف الغشاء في محكمة أمن الدولة في فترة وجيزة RT 0.1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض الفيلم في -80 درجة مئوية لمدة 6 ساعات وتطوير الفيلم. ويبين نتيجة نموذجية في الشكل 1. </li></ol> 3. rAAV3 بوساطة ناقلات تنبيغ التعبير والتحوير في خلايا سرطان الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 1x10 4 خلايا (إما أو Huh7 Hep293TT) في كل جانب من لوحة 96 - جيدا. احتضان في حاضنة ترطيب CO 2 على الأقل 18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة المتوسطة من 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 50 ميكرولتر من وسيط وبدون FBS والمضادات الحيوية وإزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من وسيط وبدون FBS والمضادات الحيوية وناقلات rAAV في 5000 VGS / الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في الحاضنة CO 2 لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل المتوسط. غسل الخلايا مرتين مع 50 ميكرولتر المتوسطة وإزالة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من طراز C - DMEM إلى كل بئر واحتضان لوحة CO 2 في الحاضنة لمدة 72 ساعة ، ووضع تصور للتعبير EGFP باستخدام مجهر مضان (DMI 4000B ؛ ايكا مايكروسيستمز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل الصور من ثلاثة آبار من الخلايا المصابة بالفيروسات كميا بواسطة ImageJ تحليل البرمجيات (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MD ، الولايات المتحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تقييم التعبير والتحوير المساحة الإجمالية للمضان أخضر (بكسل 2) في المجال البصري. ويبين نتيجة نموذجية في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا التعبير التحوير يحددها التدفق الخلوي. </li></ol> 4. ممثل النتائج : بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، يمكن للمرء أن تولد نواقل المصلي AAV بكفاءة. العائد نموذجية تحتوي على 500 ~ ~ 10 11 ميكرولتر VGS / ميكرولتر من الأسهم النقية النواقل. ويتحدد على نقاء المخزون ناقلات بمقارنة الإشارات التهجين على كمية البقع فتحة الحمض النووي ، مع وبدون هضم Benzonase. تنقية rAAV3 ناقلات تنبيغ سرطان الكبد البشري -- ورم أرومي كبدي (HB) وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) -- خطوط الخلايا بكفاءة. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. كمية الحمض النووي من خلال فتحة لطخة تحليل لتحديد التتر من rAAV3 النواقل. وقد تم تحليل شقين التخفيفات لتنقية مخزونات الفيروسي ، ويتفاعل مع Benzonase (الصف العلوي) على كمية الحمض النووي البقع مع 32 فتحة ف المسبار المسمى DNA EGFP محددة. تم تحديد من عيار AAV3 ناقلات مقارنة مع 1 نانوغرام (الصف الأوسط) أو 10 نانوغرام (الصف السفلي) من AAV - EGFP معايير البلازميد تحميلها على الغشاء. الأرقام تتطابق مع نسخ الحمض النووي. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. AAV المؤتلف بوساطة ناقلات التعبير التحوير في خلايا سرطان الكبد. وكانت الخلايا Hep293TT ، والتي أنشئت مؤخرا خلية ورم أرومي كبدي الإنسان السطر 4 ، إما (اللوحة اليسرى) وهمية المصابة ، أو مع transduced VGS 5000 / خلية إما EGFP - scAAV2 أو ناقلات scAAV3 - EGFP في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تم التحوير التعبير تصور 72 ساعة بعد تنبيغ باستخدام مجهر مضان.

<ol>
	<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).</li><li>Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV3-mediated+transfer+and+expression+of+the+pyruvate+dehydrogenase+E1+alpha+subunit+gene+causes+metabolic+remodeling+and+apoptosis+of+human+liver+cancer+cells.">AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells.</a> Mol Genet &#38; Metabol. 98, 289-299 (2009).</li><li>Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+growth+factor+receptor+is+a+cellular+coreceptor+for+adeno-associated+virus+serotype+3.">Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3.</a> Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).</li><li>Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+cancer+cell+line+derived+from+an+aggressive+childhood+liver+tumor.">Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor.</a> Pediatr Blood &#38; Cancer. 53, 1040-1047 (2009).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H., Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+adeno-associated+virus+2+vectors:+point+mutations+in+tyrosines+lead+to+high-efficiency+transduction+at+lower+doses.">Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).</li><li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+of+the+mouse+retina+by+tyrosine-mutant+AAV+serotype+vectors.">High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors.</a> Mol Ther. 17, 463-471 (2009).</li><li>Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+adeno-associated+virus+(AAV)-protein+phosphatase-5+helper+viruses+for+efficient+liver+transduction+by+single-stranded+AAV+vectors:+therapeutic+expression+of+factor+IX+at+reduced+vector+doses.">Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses.</a> Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).</li><li>Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy.">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).</li><li>Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+long-term+transduction+and+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+transduced+with+tyrosine-modified+recombinant+adeno-associated+virus+serotype+2.">Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2.</a> Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).</li><li>Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+6+capsid+tyrosine-to-phenylalanine+mutations+improve+gene+transfer+to+skeletal+muscle.">Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle.</a> Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).</li><li>Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+and+correction+of+murine+hemophilia+B+using+AAV2+vectors+devoid+of+multiple+surface-exposed+tyrosines.">High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.</a> Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).</li><li>Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+PDH+deficiency+using+AAV8-siRNA+vector-mediated+knockdown+of+pyruvate+dehydrogenase+E1&#945;.">An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1&#945;.</a> Mol Genet &#38; Metabol. 101, 183-191 (2010).</li><li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+properties+of+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+in+the+mouse+retina.">Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.</a> Mol Ther. , (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وضعت ناقلات المؤتلف على أساس البارفو غير ممرضة الإنسان ، والفيروس الغدة المرتبطة بها (AAV) ، والمستخدمة حاليا في عدد من التجارب السريرية العلاج الجيني 5. سابقا ، من الأنماط المصلية 10 AAV الأكثر شيوعا ، وقد تم الإبلاغ عن كفاءة تنبيغ من AAV3 ناقلات بصفة عامة لتكون منخفضة بشكل خاص ، سواء في المختبر والمجراة 1. ومع ذلك ، لدينا الملاحظة الأخيرة التي AAV3 ناقلات تنبيغ سرطان الكبد خطوط الخلايا البشرية بشكل جيد للغاية ، كما يحدد الكمية التي التدفق الخلوي 2 ، والتي تستخدم AAV3 النمو الكبدية البشرية مستقبلات عامل (hHGFR) كما شارك في مستقبلات الخلوية للدخول في هذه الملزمة و 3 خلايا ، توحي بقوة انتقائي الأنسجة tropism من AAV3 لخلايا الكبد البشرية بصفة عامة ، وخلايا سرطان الكبد بشكل خاص. ومع ذلك ، منذ AAV3 ناقلات تنبيغ أيضا خلايا الكبد البشرية العادية 2 بكفاءة ، واحتمال استخدامها في علاج الجينات السرطانية في الجسم الحي تطبيق ستتأثر سلبا. استراتيجية واحدة ممكنة للتحايل على هذه المشكلة المحتملة تشمل الترانسكربتي استهداف الخلايا السرطانية من خلال تحديد الجين المنتج الذي يتم انتاجه بشكل انتقائي من الورم ، ولكن ليس عن طريق خلايا الكبد الطبيعية. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات السابقة التي تستخدم مستويات مصل α - بروتين جنيني (اف ب) كعلامة محددة لتتبع وجود ، التقدم ، و / أو تكرار بعض أنواع سرطانات الكبد ، وخلايا الكبد الطبيعية منذ تنتج عادة كميات صغيرة جدا من هذا البروتين. في الواقع ، لقد استخدمنا AAV3 ناقلات تحتوي على مروج لوكالة فرانس برس في استهداف التعبير التحوير في خلايا سرطان الكبد ، ولكن ليس في خلايا الكبد الطبيعية 2 ، وتجري حاليا دراسات لاختبار فعالية هذا النهج في نموذج الفئران طعم أجنبي من سرطان الكبد. في دراساتنا إضافية ، لاحظنا أنه يمكن كفاءة تنبيغ مختلف ناقلات AAV المصلي زيادة ملموسة بنسبة الطفرات الموقع موجهة للمياه السطحية المعرضة للمخلفات في التيروزين الفيروسية capsids 14/06. حيث يتم حفظها أيضا 6 من 7 السطحية المعرضة للtyrosines في AAV3 ، وقد أجرينا موقع الطفرات الموجهة من هذه المخلفات وأشار إلى أن يتم تحسين كبير في كفاءة تنبيغ ناقلات AAV3 التيروزين ، متحولة في خلايا سرطان الكبد (بيانات غير منشورة). كما أن الدراسات التي تجري حاليا لتقييم سلامة وفعالية النواقل AAV3 التيروزين ، متحولة في نماذج طعم أجنبي الماوس لورم أرومي كبدي الإنسان وسرطان الكبد ، وإذا نجحت ، فإن الأمثل المصلي AAV3 التيروزين ، متحولة نواقل قد تكون مفيدة لاستهداف الكبد الإنسان السرطان العلاج الجيني لالمحتملين.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-0170CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HiTrap Q HP column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1154-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9753983</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodixanol gradient</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptiPrep</td>
<td>1114542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>G-50 Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>27-5330-01</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-efficiency transduction of liver cancer cells by recombinant adeno-associated virus serotype 3 vectors

نواقل المؤتلف على أساس البارفو غير الممرضة للإنسان ، وقد تم تطوير هذا الفيروس الغدة المرتبطة 2 (AAV2) ، والمستخدمة حاليا في عدد من التجارب السريرية العلاج الجيني. في الآونة الأخيرة ، وعدد من المصليين AAV إضافية كما تم المعزولة ، والتي ثبت لعرض انتقائي الأنسجة tropism في مختلف النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1. من الأنماط المصلية 10 AAV الأكثر شيوعا ، AAV3 هي حتى الآن في الأقل كفاءة transducing الخلايا والأنسجة في المختبر وكذلك في الجسم الحي. ومع ذلك ، في دراساتنا المنشورة مؤخرا ، وقد وثقت لنا أن AAV3 ناقلات تنبيغ الإنسان بسرطان الكبد -- ورم أرومي كبدي (HB) وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) -- خطوط الخلايا بكفاءة للغاية بسبب AAV3 يستخدم الإنسان مستقبلات عامل النمو الكبدية الخلوية كما شارك في لمستقبلات ملزمة والدخول في هذه الخلايا 2،3. في هذه المقالة ، نحن تصف الخطوات اللازمة لتحقيق الكفاءة العالية تنبيغ من خلايا سرطان الكبد عن طريق ناقلات المؤتلف AAV3 يحمل الجين المراسل. قد تستخدم ناقلات AAV3 المؤتلف يحمل الجين العلاجي تؤدي في نهاية المطاف إلى العلاج الجيني المحتملة لسرطان الكبد لدى البشر.

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors at JoVE.com

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

في هذه المقالة ، ونحن تصف تحديد النمط المصلي الفيروس الغدة المرتبطة 3 (AAV3) مثل ناقلات الأكثر كفاءة لاستهداف خلايا سرطان الكبد.

عالية الكفاءة تنبيغ الخلايا السرطانية الكبد المصلي المؤتلف الفيروسات الغدة المرتبطين 3 ناقلات

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

موت الخلايا المرتبطة الانقسام الشاذ التي لاحظها التصوير متحد البؤر في الخلايا السرطانية لايف

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و<em&gt; خارج الحي</em&gt; الخلايا الليفية

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

الجيل السريع والفعال للخلايا الجذعية متعددة القدرات المؤتلف الإنسان التي تتوسط Recombinase-تبادل كاسيت في<em&gt; AAVS1</em&gt; الحالة رقم

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...