Name: studying the integration of adult-born neurons
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Integration of Adult-born Neurons at JoVE.com

Эта работа финансировалась NINDS и Американской ассоциации сердца к S.Ge. Этот подход был изначально создан и разработан автором в лаборатории доктора Хунцзюнь песни в Университете Джона Хопкинса. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Хунцзюнь Песня для его руководство и поддержку.

1. Вирус инъекций Высокого титра инженерии ретровируса (1 × 10 9 ед / мл) производится котрансфекцию ретровирусных векторов и VSVG в HEK293T клетки, а затем ультрацентрифугирования вирусного супернатанта. Для источников и методов производства, см. в превосходной демонстрацией Юпитер (3). Примечание: молодые взрослые (4-6 недель) женщина C57Bl / 6 мышей (Charles River) размещаются в стандартных условиях. Все процедуры следуют Руководство Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных под протоколом утвержденным Stony Brook University IACUC. <ol><li> Оттепель 2UL замороженных ретровируса на одно животное на льду. </li><li> Анестезировать (100 мкг кетамин + 10 мкг на грамм ксилазина массы тела) и смонтировать животное на стереотаксической рамы (Steolting). Удаление волос на голове и протирать кожу 70% этанола. </li><li> Expose черепа и просверлите четыре отверстия мелкой использования бормашины (0,6 мм сверло) по следующим координатам: <ul><li> anterioposterior = -2 мм от брегмы, боковые = ± 1,6 мм, нижний = 2,5 мм; anterioposterior = -3 мм от брегмы, боковые = ± 2,6 мм, нижний = 3,2 мм. </li><li> anterioposterior = -2 мм от брегмы, боковые = ± 1,6 мм, нижний = 2,5 мм; anterioposterior = -3 мм от брегмы, боковые = ± 2,6 мм, нижний = 3,2 мм. </li></ul></li><li> Горы 1 мкл Hamilton, телевизор с плоским наконечником шприца и вводят 0,5 мкл ретровируса на участок в размере 0,25 мкл / мин в зубчатой ​​извилине. (См. выше координаты вентральной глубину.) Пауза 2 минуты после каждой инъекции перед медленно снятии шприца для предотвращения обратного потока жидкости. Между инъекциями, кратко ополосните внешнюю поверхность наконечника шприца стерильной PBS и аппликатор для удаления следов крови. </li><li> Закрыть рану стерильным хирургический шовный материал (тип П-1; Размер 6-0) и вернуть животное к стандартным условиям жилья до нужного времени этапах после инъекции. </li></ol> 2. Подготовка фрагментов Для получения высококачественных острых ломтики от взрослых мышей, мы используем модифицированный резки решение для среза подготовки (см. ниже). <ol><li> Предварительное охлаждение режущего решение до 0-4 ° С на льду и пузырь с 95% O 2 -5% CO 2 в течение 30 минут. </li><li> Анестезировать и transcardially заливать животное с ледяной насыщенных кислородом резки решение. </li><li> Быстро удалить мозг в Петри-блюдо с фильтровальной бумаги предварительно смоченную холодной, насыщенной кислородом резки решение. Отрежьте мозжечка и нарезать монтажной поверхности не менее 1 мм впереди (видимый) введение координат. Клей мозга на стадии vibrotome и смонтировать его в камеру дробления заполнена холодной и кислородом резки решение. </li><li> Подготовка корональной или горизонтальных ломтиков (300-350μm) и передавать их с большого диаметра пипетки на камеру, содержащую инкубации при комнатной температуре ACSF пузырилась с 95% O 2 / 5% СО 2. </li><li> Инкубируйте ломтиками, бурлящие непрерывно, при 32 ° С в течение 30-60 минут. Вернуться камере до комнатной температуры в течение всего срока регистрации. </li></ol> 3. Электрофизиологические эксперименты <ol><li> Фрагменты передаются в записи камеру, которая постоянно озарен насыщенных кислородом ACSF при 32 ° C - 34 ° C. </li><li> Стимуляции биполярного вольфрамовый электрод помещается в молекулярном слое зубчатой ​​извилины использованием низких микрообъектива увеличением (10х). </li><li> Новорожденные РСК в суб-зернистый зоны / зернистого слоя ячейки обозначаются выражением GFP или dTomato. Всего-клеточные patchclamp запись выполняется на новорожденных нейронов при большом увеличении (40х). </li><li> Стрельба свойства записаны клетки получаются путем введения ряда течений в соответствии с действующим зажим режиме. </li><li> Электрические стимулы доставляются стимуляции электрод через стимуляцию изолятор контролируется программное обеспечение для записи, и вызвала постсинаптических токов в РСК новорожденных регистрируются. </li></ol> 4. Анализ данных Амплитуды вызвала постсинаптические ответы анализируются на разных стадиях развития взрослого родился нейронов. 5. Представитель Результаты Использование протокола выше, GFP выражение у новорожденных нейронов зубчатой ​​извилины как на рисунке 1 является распространенным явлением. Обратите внимание, что новорожденного нейроны легко визуализировать и оба дендритов и аксонов таких стратегий прочно маркированы. Выражение в тонких ДГК аксонов и малых шипов зависит от качества и титр вируса, промоутер используются и длиной в живом выражении. В наших руках, новорожденных клеток и субклеточных органелл, как правило, видимых в течение нескольких дней после инъекции, и позвоночник выражение может быть прослежена от самых ранних стадиях развития. Wотверстие-клеточной записи с новорожденным нейронов на разных этапах времени позволяют изучения уникальных свойств новорожденных клетки, например, потенциалы действия (рис. 2а), а также процесс синаптической интеграции в существующие нейронные цепи во время созревания (рис. 2б). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рис 1 2-фотон конфокальной образ новорожденных нейронов в горизонтальной зубчатой ​​извилине разделе взрослой мыши. Зеленые клетки 21dpi (дней после инъекции) GFP-экспрессирующих новорожденных РСК помечены pUX-GFP ретровируса. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2) потенциал действия стрельбы свойства новорожденных DGC в 21 точек на дюйм. Б) представителя вызвала возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs), записанной на новорожденного DGC в 21 точек на дюйм.

<ol>
	<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis.">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li><li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain.">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Непрерывная нейрогенез в гиппокампе взрослых млекопитающих мозг дает уникальную экспериментальную систему моделью для изучения нейронных развития и интеграции в зрелом мозге. Протокол, представленные здесь сочетаются ретровирусных маркировки и электрофизиологических методов исследования интеграции новорожденных нейронов зубчатой ​​гранул в мозге взрослых мышей. Чтобы убедиться, что ваши эксперименты пройдут успешно, мы рекомендуем следующие в критические этапы процедуры: Чтобы избежать нежелательных инфекций и воспалений, все инструменты должны быть стерилизованы (автоклавированием, любой тип стерилизатор, или 70% этанола) до операции. Используйте стерильные PBS мыть кончике иглы шприца перед инъекцией. Для вируса инъекции, животные должны быть хорошо установлен на стереотаксического устройства и источники лишних движений должны быть сведены к минимуму во время инъекции. Убедитесь, что голова хорошо фиксированной и фирмы, а также настроить нос положение мыши на уровень брегмы и лямбда до расчета координат инъекции. Извлечение вирус в шприце быстро, чтобы минимизировать воздействие до комнатной температуры - ретровирусы, которые особенно чувствительны к перепадам температур. Inject вирус медленно рекомендуемая скорость, чтобы минимизировать давление повреждения. Использование рекомендованных плоским наконечником шприца (по сравнению с общим скошенным кончиком) обеспечит равномерно распределяется зубчатой ​​извилине области инфекции. Перед приготовлением ломтиками, резка решение и инкубации ACSF должны быть клокотало с 95% O 2 -5% CO 2 в течение 30 минут, чтобы насытить кислородом решений. Животные должны быть быстро и перфузии тканей поддерживаться в холодном, кислородно-насыщенный раствор для лучшего среза качества. Для регистрации, увеличение интенсивности раздражения постепенно, пока не будет постсинаптического ответа. Изменение расположения стимуляции электродов в молекулярном слое зубчатой ​​извилины по мере необходимости. Таким образом, рекомендуемый подход предлагает способ для изучения различных свойств и возможных функциональных ролей взрослого родился нейронов во время ранней стадии интеграции в активной, зрелой схемы.

<ul><li> Резка решение (в мм): 110 холина хлорид, 2,5 KCl, 1,3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO 3, 0,5 2 CaCl, MgCl 7 2, 10 декстрозы, 1,3 аскорбат натрия, 0,6 пирувата натрия, 5,0 кинуреновой кислоты. </li><li> Искусственные спинномозговой жидкости (ACSF, в мМ): NaCl 125,0, 25,0 NaHCO 3, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1,3 MgCl 2, 1,3 аскорбат натрия, 0,6 пирувата натрия, 10 декстрозы. </li><li> Внутреннее решение для цельноклеточной patchclamp (в мм): 120 глюконат калия, 15 KCl, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA, 10,0 HEPES, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 фосфокреатина (рН 7,4, 300 мОсм). </li></ul>

studying the integration of adult-born neurons

Нейрогенез происходит у взрослых млекопитающих мозги в суб-желудочковой зоны (СВЗ) бокового желудочка и в суб-зернистый зоны (SGZ) в зубчатой ​​извилине гиппокампа в течение всей жизни. Предыдущие отчеты показали, что взрослые гиппокампа нейрогенеза связана с различными расстройствами мозга, в том числе эпилепсия, шизофрения, депрессия и тревога (1). Расшифровка процесс нормальный и аберрантных взрослых родился нейрона интеграции, может пролить свет на этиологию этих заболеваний и учтены при разработке новых методов лечения. SGZ взрослого нейрогенеза зеркала эмбриональное и послеродовое развитие нейронов, в том числе этапы судьбы спецификации, миграция, синаптической интеграции и созревание. Тем не менее, полная интеграция происходит в течение длительного, 6-недельный период. Первоначальные синаптической вход взрослым родился SGZ зубчатой ​​ЗК (РСК) является ГАМК, а затем глутаматергической вход через 14 дней (2). Специфические факторы, которые регулируют схема образования взрослых родился нейронов в зубчатой ​​извилине в настоящее время неизвестны. Наша лаборатория использует репликацию с дефицитом ретровирусные вектора на основе Молони мышиного вируса лейкемии доставить флуоресцентных белков и предположили регуляторных генов этих пролиферирующих клеток. Это вирусная технология обеспечивает высокую специфичность и разрешение для проведения анализа клеточных дата рождения, происхождение, морфологии и синаптогенез. Типичном эксперименте часто используют два или три вирусов содержащие уникальный лейбл, трансгенов, и промоутер элементы для одноклеточных анализ желаемого процесса развития в естественных условиях. Следующий протокол описывает метод анализа функциональной интеграции новорожденных нейронов с помощью одного зеленого (GFP) или красный (dTomato) флуоресцентного белка ретровируса и патч-зажим электрофизиологии.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Integration of Adult-born Neurons at JoVE.com

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Способ изучения интеграции новорожденных зубчатой ​​ЗК у взрослых животных описывается. Эта техника использует инженерии ретровируса маркировать новорожденных нейронов, а затем электрофизиологические записи, чтобы определить в естественных условиях функциональной интеграции.

Изучение интеграции взрослых происхождения Нейроны

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Селективный Вирусный трансдукция взрослых происхождения обонятельных нейронов при хроническом В естественных условиях Optogenetic Стимуляция

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Microbiomechanical система для изучения формирования варикозной болезни и восстановления в Центральный нейрон аксоны

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Модель in экстракорпоральное для изучения агрегация Тау с использованием ленто-вирусно-опосредованное производство нейронов человека

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

Беспроводная электрофизиологическая запись нейронов movable Tetrodes в Свободно плавающих рыб

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Изучение предварительно сформированных Фибриль Индуцированных -Synuclein накопления в первичной эмбриональной мыши midbrain допамина нейронов

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Активность афферентных нейронов задней боковой линии во время плавания у рыбок данио

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...