Name: efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00
Duration: 4 min 54 s
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1。使原生质体<ol><li>加入9 mL的8％甘露醇培养皿。 </li><li>使用压舌板，放2-3 PPNH4板5 - 7天的老苔培养皿中含有甘露醇。 </li><li>加入3毫升2％Driselase D9515 - 25G（Sigma公司）的培养皿中。 </li><li>轻轻摇晃1小时的培养皿中，在室温下孵育。 </li><li>原生质体悬浮液过滤器通过一个100微米的目（屋宇署猎鹰352350）。 </li><li>旋转250克5分钟，过滤悬浮。去除上清。 </li><li>重悬原生质体轻轻8％甘露醇500μL。 </li><li>加入9.5 mL的培养管的8％甘露醇。确保原生质体是完全暂停。 </li><li>重复过滤和再悬浮的步骤（1.6，1.7和1.8）两次。 </li><li>取10μL的原生质体解决方案，并在一个血球计数原生质体。 </li><li> 10,000乘以原生质体在一个16平方米的面积获得每毫升的原生质体的数量（见图1）。 </li></ol> 2。转型<ol><li>原生质体悬浮液旋转250克5分钟。去除上清。 </li><li>再暂停160万原生质体/ ml的浓度在MMG的解决方案的原生质体。 </li><li>原生质体悬浮液在室温下孵育20分钟。 </li><li> 600原生质体悬浮液加入含有60微克的DNA成为一种文化管。轻轻涡流管。 </li><li>原生质体/ DNA混合物中加入700μLPEG / CA解决方案。管轻轻摇动，直到整个混合物均匀。 </li><li>在室温下孵育30分钟的混合物。 </li><li>在此等待期间，用玻璃纸覆盖PRM - B板（80毫米直径的圆圈，AA包装有限公司，英国）;玻璃纸水合物板面允许至少5分钟。 </li><li>用抹刀，删除任何空气被困玻璃纸和板块之间的气泡。 </li><li> W5的解决方案与3毫升稀释的混合物。 </li><li>旋转250克5分钟的混合物。去除上清。 </li><li>在融化的PRM - T的2毫升重新暂停原生质体（将它添加到该解决方案可以保持在42 ° C的液体原生质体之前，）。板1毫升每玻璃纸覆盖的PRM - B板重新挂起原生质体。包装板微孔（3M公司，保健）。在生长室中，保持在25 ° C的板。 </li><li>此外，原生质体可重新悬浮于1毫升液体电镀液和电镀0.5毫升用玻璃纸覆盖了PRM - B板。这将允许更快的再生，但再生植物的数量较低。 </li><li>生长室设置了16小时。光照和8小时。暗周期。 </li><li>移动到4天，改造后的新鲜选择板的玻璃纸。 </li></ol> 3。代表性的成果： 转型的一个例子是如图2所示。在这个例子中使用的DNA是一个超螺旋的7.8 kb的质粒携带潮霉素抗性卡带。镀原生质体的数量减少到50％摄影。照片拍摄两周后，被转移到植物的选择板。转化效率是不影响DNA浓度高达60微克。高浓度的DNA转化效率是不利的。数据表明，该方法提供了较广泛的DNA金额一致的结果。这种方法也可以产生稳定的转化，有效，如表1所示，我们可以得到约4％微克的线性DNA，这是远远比以前 14报道的稳定转化。 我们还测试了一个超螺旋质粒携带一个荧光蛋白作为标记基因转化的热休克转化效率的影响。热休克进行了室温孵育10分钟后（在步骤2.6）在45 ° C为3分钟的水浴孵育混合物。混合物在室温水浴孵育后立即热休克17分钟。结果改造后的22个小时。获得的转化和未经热休克的比率非常相似（〜25％），但我们观察到原生质体（数据未显示）的可行性热休克的不利影响。 <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。血球原生质体 ，原生质体计数所需的部分是由一个红色正方形表示。注意计数原生质体（见1.11）所需的16个广场;的图像显示了24原生质体数（24万细胞/ mL）。 <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。 18日龄的瞬态转化的图片。原生质体转运形成超螺旋质粒表示。答：15μg; B：30μg，C：60μg，D：120μg。 <table border="1"><tbody><tr><td> DNA的量（微克） </td><td> 效率（tranformants /微克DNA） </td></tr><tr><td> 15，超螺旋质粒</td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30，超螺旋质粒</td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60，超螺旋质粒</td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120，超螺旋质粒</td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60，线性质粒</td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> 表1：在不同的DNA量的转化效率。

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	<li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts:+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression.">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li><li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bryophytes+as+model+systems.">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li><li>Schaefer, D. G., Zr&#255;d, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li><li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens.">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li><li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moss+Physcomitrella+patens.">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li><li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens:+homologous+recombination,+concatenation+and+multiple+integration.">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li><li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth.">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li><li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun.">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li><li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens.">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li><li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li><li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements.">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li><li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss,+Physcomitrella+patens.">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li><li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li></ol>

这里介绍的方法可以直接和一致的DNA转化成小立碗藓原生质体。该方法最初用于拟南芥 1，但在这里，我们表明，它执行与小立碗藓 ，一个简单的和不同的植物原生质体。因此，这种方法可以应用到其他植物物种，稍作修改。优化的可能的修改包括原生质体的浓度在MMG，MMG和PEG / CA解决方案的孵化时间。我们选择在我们日常的实验中使用60微克的DNA，因为转化与DNA浓度呈线性增加，直到这一点（见表1）。我们可以得到约7000瞬态转化一个单一的60微克DNA转化，这为进一步筛选和分析人口众多的植物，或200个稳定转化。 转化原生质体可以是液体电镀中等或PRM - T的蔓延。虽然再生效率较低时使用液体电镀液中，我们选择这种方法时，原生质体与超螺旋质粒转化。如表1显示，超螺旋质粒DNA的转换生成更多的转化，因此，我们仍然可以用液体电镀液中获得大量的植物。此外，传播与液体电镀液的原生质体，允许更快的再生，这是非常重要的实验涉及瞬态的表型，如RNA 干扰 ，击倒实验9,15的。此外，高层琼脂的情况下允许免疫组化和RT - PCR检测9,15容易植物隔离。

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 成分 </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1.84毫米KH 2 PO 4 3.4毫米的Ca（NO 3）2 1毫米硫酸镁4 2.72 mM的二铵酒石酸 54微米FESO 4 .7 H 2 O 9.93μMH 3 BO 3 1.97μMMnCl 2 .4 H 2 O 0.23μMCoCl 2 .6 H 2 O 硫酸锌0.19μM。 7H 2 O 0.22微米硫酸铜4。 5H 2 O 0.10μM娜2的MoO 4 .2 H 2 O 0.168μM碘化钾 添加0.7％琼​​脂固体培养基。 </td></tr><tr><td> PRM - B </td><td> PPNH 4，6％甘露醇和0.8％琼脂。浇筑前板，添加10毫升1M 氯化钙 2至1 L 。 </td></tr><tr><td> PRM - T </td><td> PPNH 4，6％甘露醇和0.6％的琼脂。添加0.5毫升1M氯化钙使用前的2至50毫升。 </td></tr><tr><td>液体电镀中等</td><td> PPNH 4和8.5％，无琼脂甘露醇。添加0.5毫升1M氯化钙使用前的2至50毫升。 </td></tr><tr><td> 2％Driselase </td><td>添加4克Driselase D9515 - 25G（Sigma公司）的8％甘露醇200毫升。轻轻搅拌30分钟。在室温下孵育30分钟。在4 ° C，并轻轻搅拌5分钟。在室温下。 10分钟旋转2500克，丢弃沉淀。与0.22微米，10毫升分装冷冻储存过滤。使用前在室温水浴解冻。 </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0.4中号甘露醇 15毫米氯化镁2 4毫米的MES（pH值5.7） </td></tr><tr><td> PEG / CA </td><td> 4克PEG4000 3 mL的H 2 O 2.5毫升0.8甘露醇中号 1毫升1M 氯化钙 </td></tr><tr><td> W5号</td><td> 154 mM氯化钠 125毫米氯化钙2 5 mM的氯化钾 2毫米的MES（pH值5.7） </td></tr></tbody></table>

efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt;一个简单而有效的方法来改造<em&gt;小立碗pantens</em&gt;原生质体的描述。这种方法是改编自协议<em&gt; Physocmitrella</em&gt; protonemal原生质体和<em&gt;拟南芥</em&gt;叶肉原生质体转化<sup&gt; 1</sup&gt;。由于其容量，进行高效的有丝分裂，同源重组<em&gt;，小立碗藓</em&gt;已经成为一个重要的模型系统近年来<sup&gt; 2</sup&gt;。这种能力允许高频率的基因定位<sup&gt; 3-9</sup&gt;，这是没有看到在其他模式植物，如<em&gt;拟南芥</em&gt;。要充分利用本系统，我们需要一种有效，简便的方法来传递到苔细胞的DNA。最常见的方法来改造这个苔粒子轰击<sup&gt; 10</sup&gt;和PEG介导的DNA摄取<sup&gt; 11</sup&gt;。虽然粒子轰击可以生产出高转换效率<sup&gt; 12</sup&gt;，基因枪是没有现成的许多实验室和协议是难以标准化。另一方面，PEG介导的转化并不需要专门的设备，并且可以在任何实验室用无菌罩。在这里，我们展示一个简单高效的方法，苔原生质体转化。这种方法可以产生每超过120微克的DNA，这是一个从先前公布的最有效的协议的改善瞬态转化<sup&gt; 13</sup&gt;。由于它的简单性，效率和可重复性，这种方法可以应用以及需要大量转化为日常改造项目。</p

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Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

一个简单而有效的方法来改造<em&gt;小立碗pantens</em&gt;原生质体的描述。这种方法是改编自协议<em&gt; Physocmitrella</em&gt; protonemal原生质体和<em&gt;拟南芥</em&gt;叶肉原生质体转化<sup&gt; 1</sup&gt;。

高效的聚乙二醇（PEG）介导的转化苔小立碗藓</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Research

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Biology

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