Name: efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00
Duration: 4 min 54 s
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1. Protoplasts बनाना <ol><li> 8% एक पेट्री डिश को mannitol 9 एमएल जोड़ें. </li><li> पेट्री डिश युक्त mannitol में - एक रंग का प्रयोग, 2-3 के 5 PPNH4 प्लेटें से 7 दिन पुराने काई डाल दिया. </li><li> पेट्री डिश में 2% की Driselase के 3 एमएल (सिग्मा D9515-25g) जोड़ें. </li><li> कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ पेट्री डिश सेते हैं. </li><li> 100 सुक्ष्ममापी मेष (बी फाल्कन 352350) के माध्यम से मूलतत्त्व निलंबन फ़िल्टर. </li><li> 5 मिनट के लिए 250 ग्राम पर फ़िल्टर निलंबन स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें. </li><li> Protoplasts 8% mannitol के 500 μL के साथ बहुत धीरे पुनः निलंबित. </li><li> संस्कृति ट्यूब में 9.5 एमएल 8% mannitol जोड़ें. सुनिश्चित करें protoplasts पूरी तरह से निलंबित कर रहे हैं. </li><li> छानने का काम और फिर निलंबन (1.6, 1.7 और 1.8) कदम दो बार दोहराएँ. </li><li> आदर्श समाधान के 10 μL ले लो और एक hemocytometer में protoplasts गिनती. </li><li> एमएल प्रति protoplasts की संख्या (चित्रा 1 देखें) प्राप्त 10,000 द्वारा एक 16 वर्ग क्षेत्र में आदर्श की संख्या गुणा. </li></ol> 2. परिवर्तन <ol><li> 5 मिनट के लिए 250 ग्राम पर मूलतत्त्व निलंबन स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें. </li><li> 1.6 मिलियन protoplasts / एमएल की एकाग्रता पर MMg समाधान में protoplasts पुन-निलंबित. </li><li> कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मूलतत्त्व निलंबन सेते हैं. </li><li> एक संस्कृति ट्यूब में 60 μg डीएनए युक्त मूलतत्त्व निलंबन के 600 μL जोड़ें. ट्यूब धीरे भंवर. </li><li> मिश्रण / मूलतत्त्व डीएनए में खूंटी / Ca समाधान के 700 μL जोड़ें. भंवर ट्यूब धीरे जब तक पूरे मिश्रण सजातीय है. </li><li> कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं. </li><li> यह प्रतीक्षा अवधि के दौरान, सिलोफ़न के साथ PRM-B प्लेटें (80 मिमी व्यास हलकों, ए.ए. पैकेजिंग लिमिटेड, ब्रिटेन) को कवर, कम से कम 5 मिनट के लिए थाली की सतह पर हाइड्रेट सिलोफ़न की अनुमति. </li><li> एक रंग के साथ, किसी भी हवाई बुलबुले सिलोफ़न और प्लेट के बीच फंस हटा दें. </li><li> W5 समाधान के 3 एमएल के साथ मिश्रण पतला. </li><li> 5 मिनट के लिए 250 ग्राम मिश्रण स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें. </li><li> PRM-टी पिघला 2 एमएल में पुनः निलंबित protoplasts (यह protoplasts 42 ° C में इस समाधान तरल रखा जा सकता है जोड़ने से पहले). PRM-B सिलोफ़न द्वारा कवर की थाली के प्रति फिर से निलंबित protoplasts के 1 एमएल प्लेट. Micropore (3M, स्वास्थ्य देखभाल) के साथ प्लेटें लपेटें. 25 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में प्लेटों का रखें. </li><li> वैकल्पिक रूप से, protoplasts किया जा सकता है तरल चढ़ाना मध्यम और एक PRM-B सिलोफ़न के साथ कवर प्लेट पर चढ़ाया 0.5 एमएल के 1 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया. यह तेजी से उत्थान की अनुमति देता है, लेकिन regenerating के पौधों की संख्या कम है. </li><li> ग्रोथ चैम्बर एक 16 घंटे के लिए सेट कर दिया जाता है. प्रकाश और 8 घंटा. अंधेरे चक्र. </li><li> 4 दिनों के परिवर्तन के बाद एक ताजा चयन थाली पर सिलोफ़न ले जाएँ. </li></ol> 3. प्रतिनिधि परिणाम: परिवर्तन का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता डीएनए supercoiled 7.8 प्लाज्मिड केबी hygromycin प्रतिरोधी कैसेट ले गया था. मढ़वाया protoplasts की राशि फोटोग्राफी के लिए 50% कम हो गया था. तस्वीरें ले जाया गया दो सप्ताह के बाद पौधों चयन प्लेटों के लिए चले गए थे. परिवर्तन दक्षता 60 μg डीएनए एकाग्रता द्वारा प्रभावित नहीं है. डीएनए के उच्च सांद्रता परिवर्तन की दक्षता के लिए हानिकारक हैं. आंकड़ों से पता चला है कि इस विधि के डीएनए की मात्रा की एक विस्तृत श्रृंखला में लगातार परिणाम उद्धार. यह विधि भी स्थिर प्रभावी रूप से तालिका 1 में दिखाया transformants उत्पन्न कर सकते हैं, हम linearized डीएनए, जो जो 14 पहले से सूचना मिली थी की तुलना में ज्यादा है माइक्रोग्राम प्रति 4 स्थिर transformants के बारे में प्राप्त कर सकते हैं. हम भी एक supercoiled एक मार्कर के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक जीन ले जाने प्लाज्मिड बदलने के द्वारा परिवर्तन की क्षमता पर गर्मी के सदमे से प्रभाव का परीक्षण किया. गर्मी झटका बाहर किया गया था एक 3 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मिश्रण incubating द्वारा कमरे के तापमान ऊष्मायन के बाद 10 मिनट (2.6 चरण के भीतर). मिश्रण एक कमरे के तापमान पानी से स्नान में incubated तुरंत बाद 17 मिनट के लिए गर्मी झटका. परिणाम परिवर्तन के 22 घंटे बाद दर्ज किया गया. के साथ प्राप्त transformants की और बिना गर्मी झटका अनुपात बहुत इसी तरह की (~ 25%) थे, लेकिन हम protoplasts (नहीं दिखाया डेटा है) की व्यवहार्यता पर गर्मी सदमे से एक प्रतिकूल प्रभाव मनाया. <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="चित्रा 1" /> चित्रा 1. Hemocytometer में protoplasts के मूलतत्त्व गिनती के लिए आवश्यक अनुभाग देखें एक लाल वर्ग ने संकेत दिया है . नोट protoplasts (1.11 देखें) की गिनती के लिए आवश्यक 16 चौकों, छवि 24 protoplasts (240,000 कोशिकाओं / एमएल) की गणना से पता चलता है. <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="चित्रा 2" /> चित्रा 2. 18 दिन पुराने क्षणिक transformants के चित्र Protoplasts. ट्रांस थेsupercoiled प्लाज्मिड के संकेत राशि के साथ बनाई है. एक: 15μg, बी: 30μg, सी: 60μg, डी: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> डीएनए (μg) की राशि </td><td> क्षमता (tranformants / μg डीएनए) </td></tr><tr><td> 15, प्लाज्मिड supercoiled </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, प्लाज्मिड supercoiled </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, प्लाज्मिड supercoiled </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, प्लाज्मिड supercoiled </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, प्लाज्मिड linearized </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> टेबल 1 विभिन्न डीएनए मात्रा में परिवर्तन दक्षता.

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	<li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts:+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression.">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li><li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bryophytes+as+model+systems.">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li><li>Schaefer, D. G., Zr&#255;d, J. -. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements.">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li><li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss,+Physcomitrella+patens.">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. 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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

यहाँ प्रस्तुत विधि एक सरल और सुसंगत Physcomitrella patens protoplasts में डीएनए परिवर्तन के लिए सक्षम बनाता है. इस पद्धति का मूल एक Arabidopsis के लिए विकसित किया गया था, लेकिन हम यहाँ दिखा दिया है कि यह Physcomitrella patens, एक सरल और विभिन्न संयंत्र के protoplasts के साथ अच्छी तरह से करता है. इसलिए, इस विधि मामूली संशोधनों के साथ अन्य प्रजातियों के पौधे को लागू किया जा सकता है. अनुकूलन के लिए संभावित संशोधनों MMg MMg और / खूंटी Ca समाधान में ऊष्मायन समय में मूलतत्त्व एकाग्रता शामिल हैं. हम हमारी दिनचर्या प्रयोगों में 60 μg डीएनए का उपयोग करना चुनते हैं क्योंकि transformants की संख्या डीएनए एकाग्रता के साथ linearly इस बिंदु (1 टेबल) तक बढ़ जाती है. हम लगभग 7000 क्षणिक या एक एकल 60 μg डीएनए परिवर्तन, जो आगे और पौधों की एक बड़ी आबादी की स्क्रीनिंग के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है पर transformants 200 स्थिर transformants मिल सकता है. तब्दील protoplasts तरल चढ़ाना मध्यम या PRM-टी के साथ या तो फैल सकता है. हालांकि उत्थान दक्षता जब तरल चढ़ाना मध्यम प्रयोग किया जाता है कम है, हम इस विधि का चयन जब protoplasts supercoiled plasmids के साथ बदल रहे थे. जैसा कि तालिका 1 में दिखाया है, supercoiled प्लास्मिड डीएनए के साथ किया परिवर्तनों कई और अधिक transformants उत्पन्न और इस प्रकार, हम अभी भी तरल चढ़ाना माध्यम के साथ पौधों की बड़ी संख्या प्राप्त कर सकते हैं. इसके अलावा, तरल चढ़ाना माध्यम से फैल protoplasts तेजी से उत्थान, जो आरएनएआई जैसे क्षणिक phenotypes, दस्तक नीचे 9,15 प्रयोगों से जुड़े प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है की अनुमति देता है. इसके अलावा शीर्ष अगर के अभाव immunostaining और RT-पीसीआर 9,15 के लिए आसान संयंत्र अलगाव के लिए अनुमति देता है .

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> घटक </td></tr><tr><td> 4 PPNH </td><td> 1.84 मिमी 2 के.एच. पीओ 4 3.4 मिमी (3 सं) Ca 2 1 मिमी MgSO 4 2.72 मिमी Diammonium tartrate 54 FeSO 4 0.7 एच 2 हे सुक्ष्ममापी 9.93 सुक्ष्ममापी 3 एच 3 बो 1.97 MnCl 2 0.4 एच 2 हे सुक्ष्ममापी 0.23 सुक्ष्ममापी 2 0.6 एच 2 हे CoCl 0.19 4 ZnSO सुक्ष्ममापी. 7 2 हे 0.22 4 CuSO सुक्ष्ममापी. 5H 2 हे 0.10 सुक्ष्ममापी ना Moo 2 4 0.2 एच 2 हे 0.168 सुक्ष्ममापी केआई ठोस माध्यम के लिए 0.7% अगर जोड़ें. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> 6% और 0.8% mannitol अगर साथ 4 PPNH. प्लेटें गिरने से पहले 10 एमएल 1M CaCl 2 से 1 एल जोड़ें. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> 6% और 0.6% mannitol अगर साथ 4 PPNH. 0.5 एमएल 1M उपयोग करने से पहले 2 से 50 एमएल CaCl जोड़ें. </td></tr><tr><td> लिक्विड चढ़ाना मध्यम </td><td> अगर बिना 8.5% mannitol के साथ 4 PPNH . 0.5 एमएल 1M उपयोग करने से पहले 2 से 50 एमएल CaCl जोड़ें. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Driselase के 4 ग्राम (सिग्मा D9515-25g) 8% mannitol के 200 एमएल जोड़ें. 30 मिनट के लिए धीरे हिलाओ. कमरे के तापमान पर, 30 मिनट सेते हैं. 4 में डिग्री सेल्सियस, और 5 मिनट के लिए धीरे हलचल. कमरे के तापमान पर. 10 मिनट के लिए 2500 ग्राम स्पिन, गोली त्यागें. 0.22 सुक्ष्ममापी, और स्टोर 10 एमएल aliquots के रूप में जमे हुए के साथ फ़िल्टर. उपयोग करने से पहले एक कमरे के तापमान पानी से स्नान में पहले गला लें. </td></tr><tr><td> MMg </td><td> 0.4 एम mannitol 15 मिमी 2 MgCl 4 मिमी एमईएस (5.7 पीएच) </td></tr><tr><td> / खूंटी Ca </td><td> 4 PEG4000 जी 3 एमएल एच 2 हे 2.5 एमएल 0.8 एम mannitol 1 एमएल 1M 2 CaCl </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 मिमी NaCl 125 मिमी 2 CaCl 5 मिमी KCl 2 मिमी एमईएस (5.7 पीएच) </td></tr></tbody></table>

efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens

Physcomitrella pantens protoplasts परिणत करने के लिए एक सरल और कुशल विधि वर्णित है. इस विधि Physocmitrella protonemal मूलतत्त्व और Arabidopsis mesophyll मूलतत्त्व एक परिवर्तन के लिए प्रोटोकॉल से अनुकूलित है. अपनी कुशल mitotic मुताबिक़ पुनर्संयोजन गुजरना क्षमता के कारण, Physcomitrella patens महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली के रूप में हाल ही में 2 वर्षों में उभरा है. इस क्षमता जीन की उच्च आवृत्तियों 3-9 लक्ष्यीकरण, जो Arabidopsis जैसे अन्य मॉडल पौधों में नहीं देखा है की अनुमति देता है. इस प्रणाली के पूर्ण लाभ लेने के लिए, हम एक प्रभावी और आसान विधि काई कोशिकाओं में डीएनए देने की जरूरत है. इस काई को बदलने के लिए सबसे आम तरीके कण 10 बमबारी और खूंटी की मध्यस्थता डीएनए तेज 11 कर रहे हैं. हालांकि कण बमबारी में एक उच्च परिवर्तन 12 दक्षता का उत्पादन कर सकते हैं, जीन बंदूकें आसानी से कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं प्रोटोकॉल के मानकीकरण के लिए मुश्किल है. दूसरी ओर, खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं करता, और किसी भी प्रयोगशाला में एक बाँझ हुड के साथ किया जा सकता है है. यहाँ, हम काई protoplasts के परिवर्तन के लिए एक सरल और अत्यधिक कुशल तरीका दिखा. इस विधि डीएनए है, जो सबसे कुशल प्रोटोकॉल से एक सुधार है माइक्रोग्राम प्रति 120 से अधिक क्षणिक transformants उत्पन्न पहले से 13 की रिपोर्ट कर सकते हैं. अपनी सादगी, दक्षता, और reproducibility की वजह से, इस विधि transformants की बड़ी संख्या दिनचर्या परिवर्तन के लिए की आवश्यकता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परियोजनाओं के लिए लागू किया जा सकता है.

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Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

एक सरल और कुशल पद्धति को बदलने<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasts वर्णित है. प्रोटोकॉल से इस विधि के लिए अनुकूलित है<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal मूलतत्त्व और<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesophyll मूलतत्त्व परिवर्तन<sup&gt; 1</sup&gt;.

कुशल polyethylene glycol (खूंटी) मॉस की मध्यस्थता परिवर्तन Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Research

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Biology

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

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