Name: efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens at JoVE.com

LV stöds av NSF (IOS 1.002.837)

1. Göra Protoplasts <ol><li> Lägg till 9 ml på 8% mannitol till en petriskål. </li><li> Med hjälp av en spatel, satte 7 dagar gammal mossa 2-3 PPNH4 plattor av 5 - i petriskålen innehåller mannitol. </li><li> Tillsätt 3 ml 2% Driselase (Sigma D9515-25G) till petriskål. </li><li> Inkubera petriskål vid rumstemperatur med försiktig skakning i 1 timme. </li><li> Filtrera protoplastfusion fjädring genom en 100 ìm mesh (BD Falcon 352.350). </li><li> Snurra filtreras fjädring på 250 g för 5 minuter. Avlägsna supernatanten. </li><li> Återuppslamma protoplasts mycket försiktigt med 500 mikroliter 8% mannitol. </li><li> Tillsätt 9,5 ml 8% mannitol i kulturen röret. Se protoplasts helt upphävas. </li><li> Upprepa filtrering och resuspension steg (1,6, 1,7 och 1,8) två gånger till. </li><li> Ta 10 mikroliter av protoplastfusion lösningen och räkna protoplasts i en hemocytometer. </li><li> Multiplicera antalet protoplastfusion i en 16 kvadratmeter yta med 10.000 för att få antalet protoplasts per ml (se figur 1). </li></ol> 2. Omvandling <ol><li> Snurra protoplastfusion fjädring på 250 g för 5 minuter. Avlägsna supernatanten. </li><li> Återsuspendera protoplasts i MMG lösning vid koncentrationen 1,6 miljoner protoplasts / ml. </li><li> Inkubera protoplastfusion suspensionen vid rumstemperatur i 20 minuter. </li><li> Tillsätt 600 mikroliter av protoplastfusion suspensionen i en kultur rör som innehåller 60 mikrogram DNA. Snurra röret försiktigt. </li><li> Tillsätt 700 mikroliter av PEG / Ca lösningen i protoplastfusion / DNA-blandning. Snurra slangen försiktigt tills hela blandningen är homogen. </li><li> Inkubera blandningen i rumstemperatur i 30 minuter. </li><li> Under denna väntetid, täcka PRM-B plattor med cellofan (80 mm diameter cirklar, AA Packaging Limited, Storbritannien), låt cellofan för att återfukta på tallriken ytan i minst 5 minuter. </li><li> Med en spatel, avlägsna eventuella luftbubblor fastnar mellan cellofan och plattan. </li><li> Späd blandningen med 3 ml W5 lösning. </li><li> Snurra på blandningen på 250 g för 5 minuter. Avlägsna supernatanten. </li><li> Återsuspendera protoplasts i smält 2 mL PRM-T (innan den läggs till protoplasts denna lösning kan hållas flytande vid 42 ° C). Plate 1 mL återsuspendera protoplasts per PRM-B plåt som omfattas av cellofan. Linda plattor med Micropore (3M Hälsovård). Håll plattorna vid 25 ° C i en tillväxt kammare. </li><li> Alternativt kan protoplasts åter skjutas i 1 ml vätska plätering medelstora och pläterade 0,5 ml på en PRM-B plåt täckt med cellofan. Detta möjliggör snabbare förnyelse, men antalet regenererande plantor är lägre. </li><li> Tillväxten kammare är inställd på en 16 timmar. ljus och 8 tim. mörker-cykel. </li><li> Flytta cellofan på att ett nytt urval tallrik 4 dagar efter omvandling. </li></ol> 3. Representativa resultat: Ett exempel på omvandling visas i figur 2. De DNA används i detta exempel var en supercoiled 7,8 kb plasmid som bär en kassett hygromycin resistenta. Mängden pläterade protoplasts sänktes till 50% för fotografering. Bilderna togs två veckor efter växterna flyttades till val av plattorna. Omvandlingen effektivitet påverkas inte av DNA-koncentrationen till 60 mikrogram. Högre koncentrationer av DNA är till skada för effektiviteten i omvandlingen. Uppgifterna visade att denna metod ger jämna resultat över ett brett spektrum av DNA-mängder. Denna metod kan även generera stabila transformants effektivt som visas i tabell 1, vi kan få om fyra stabila transformants per mikrogram linjäriserade DNA, vilket är mycket högre än vad som tidigare rapporterats 14. Vi testade även inverkan av värme chock på omvandlingseffektiviteten genom att förvandla en supercoiled plasmid bär en gen för ett fluorescerande protein som markör. Värmen chock genomfördes 10 minuter efter rumstemperatur inkubering (inom Steg 2,6) genom inkubering av blandningen i en 45 ° C vattenbad under 3 minuter. Blandningen var inkuberas i rumstemperatur vattenbad direkt efter värme chock för 17 min. Resultaten redovisades 22 timmar efter omvandling. Förhållandena för transformants erhållas med och utan värme chock var mycket lika (~ 25%), men vi observerade en negativ effekt av värme chock på livskraft protoplasts (data visas inte). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Vy över protoplasts i hemocytometer. Avsnittet som behövs för protoplastfusion räkna indikeras med en röd fyrkant. Notera den 16 rutor som behövs för att räkna protoplasts (se 1.11), bilden visar en sammanräkning av 24 protoplasts (240 tusen celler / ml). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Bilder på 18 dygn gamla övergående transformants. Protoplasts överfördesbildas med den angivna mängden supercoiled plasmid. A: 15μg, B: 30 mikrogram, C: 60μg, D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Mängd DNA (mikrogram) </td><td> Effektivitet (tranformants / mikrogram DNA) </td></tr><tr><td> 15, supercoiled plasmid </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, supercoiled plasmid </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, supercoiled plasmid </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, supercoiled plasmid </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, temperaturlinjär plasmid </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Omvandlingseffektiviteten på olika DNA-mängder.

<ol>
	<li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts:+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression.">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li><li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bryophytes+as+model+systems.">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li><li>Schaefer, D. G., Zr&#255;d, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li><li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens.">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li><li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moss+Physcomitrella+patens.">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li><li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens:+homologous+recombination,+concatenation+and+multiple+integration.">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li><li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth.">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li><li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun.">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li><li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens.">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li><li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li><li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements.">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li><li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss,+Physcomitrella+patens.">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li><li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li></ol>

Den metod som presenteras här ger en enkel och konsekvent DNA omvandling till muddermossa patens protoplasts. Metoden utvecklades ursprungligen för Arabidopsis 1, men här har vi visat att det fungerar bra med protoplasts av muddermossa patens, en enklare och annan anläggning. Därför kan denna metod tillämpas på andra arter med smärre modifieringar. Möjliga ändringar för optimering inkluderar protoplastfusion koncentration i MMG, inkubationstid på MMG och PEG / Ca lösning. Vi väljer att använda 60 mikrogram DNA i våra rutiner experiment eftersom antalet transformants ökar linjärt med DNA-koncentration till denna punkt (tabell 1). Vi skulle kunna få cirka 7000 övergående transformants eller 200 stabilt transformants på en enda 60 mikrogram DNA-omvandling, vilket möjliggör ytterligare screening och analys av en stor population av växter. Den förvandlade protoplasts kan antingen spridas med flytande plätering medium eller PRM-T. Även om förnyelse effektivitet är lägre när vätskan plätering medium används, väljer vi den här metoden när protoplasts förvandlades med supercoiled plasmider. Som visade i tabell 1, transformationer görs med supercoiled plasmid-DNA generera många fler transformants och därmed kan vi fortfarande få ett stort antal anläggningar med flytande plätering medium. Dessutom sprider protoplasts med vätska plätering medelstora möjliggör snabbare förnyelse, vilket är viktigt för försök med övergående fenotyper, såsom RNAi riva experiment 9,15. Förutom avsaknad av övre agar möjliggör enkel anläggning isolering för immunfärgning och RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Ingrediens </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mm Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM Diammoniumhydrogenortofosfat tartrate 54 mikroM FeSO 4 0,7 H 2 O 9,93 mikroM H 3 BO 3 1,97 mikroM MnCl 2 0,4 H 2 O 0,23 mikroM CoCl 2 0,6 H 2 O 0,19 mikroM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 mikroM CuSO 4. 5H 2 O 0,10 mikroM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 mikroM KI Tillsätt 0,7% agar för fasta medium. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 med 6% mannitol och 0,8% agar. Tillsätt 10 ml 1M CaCl 2 till 1 liter innan det hälls plattor. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 med 6% mannitol och 0,6% agar. Tillsätt 0,5 ml 1M CaCl 2 till 50 ml före användning. </td></tr><tr><td> Flytande Plating Medium </td><td> PPNH 4 med 8,5% mannitol utan agar. Tillsätt 0,5 ml 1M CaCl 2 till 50 ml före användning. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Tillsätt 4 g Driselase (Sigma D9515-25G) till 200 ml på 8% mannitol. Rör försiktigt i 30 min. vid rumstemperatur, inkubera 30 min. vid 4 ° C, och rör försiktigt i 5 min. vid rumstemperatur. Spin 2500 g under 10 minuter, kasta pellet. Filter med 0,22 ìm, och lagra frysta som 10 ml alikvoter. Tina i rumstemperatur vattenbad före användning. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 ml H 2 O 2,5 ml 0,8 M mannitol 1 ml 1M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mm CaCl 2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens

En enkel och effektiv metod att omvandla muddermossa pantens protoplasts beskrivs. Denna metod är anpassad från protokoll för Physocmitrella protonemal protoplastfusion och Arabidopsis mesophyll protoplastfusion omvandlingen 1. Tack vare sin förmåga att genomgå en effektiv mitotiska homolog rekombination, har muddermossa patens vuxit fram som ett viktigt modellsystem under de senaste åren 2. Denna förmåga gör att höga frekvenser av riktad genmodifiering 3-9, vilket inte syns i annan modell växter såsom Arabidopsis. För att dra full nytta av detta system behöver vi en effektiv och enkel metod för att leverera DNA i mossa celler. De vanligaste sätten att omvandla denna mossa är partikel bombardemang 10 och PEG-medierade DNA-upptag 11. Även partikel bombardemang kan producera en hög omvandlingseffektiviteten 12, gen vapen är inte lätt tillgänglig för många laboratorier och protokollet är svår att standardisera. Å andra sidan, kräver PEG medierad omvandling inte specialiserad utrustning, och kan utföras på alla laboratorier med en steril huva. Här visar vi en enkel och mycket effektiv metod för omvandling av mossa protoplasts. Denna metod kan generera mer än 120 övergående transformants per mikrogram av DNA, vilket är en förbättring från den mest effektiva protokollet tidigare rapporterade 13. På grund av sin enkelhet, effektivitet och reproducerbarhet, kan denna metod tillämpas på projekt som kräver stort antal transformants samt för rutinmässig omvandling.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens at JoVE.com

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

En enkel och effektiv metod att omvandla<em&gt; Muddermossa pantens</em&gt; Protoplasts beskrivs. Denna metod är anpassad från protokoll för<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastfusion och<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesophyll protoplastfusion omvandling<sup&gt; 1</sup&gt;.

Effektiv polyetylenglykol (PEG) medierad Omvandling av Moss Muddermossa patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Miljömässigt Inducerad Heritable Förändringar i Lin

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Frysförvaring av musembryon av etylenglykol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomiskt Transformation av Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Medierad omogen embryoomvandling av motsträviga majs inavlade linjer med morfogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Förbereda och injicera embryon från Culex myggor för att generera nullmutationer med CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-medierad genetisk omvandling, Transgen produktion, och dess tillämpning för studiet av manlig reproduktiv utveckling i Ris

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Hyperaktiv piggyBac Transposase-medierad bakterieomvandling i höstarmén, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Naturlig transformation, proteinuttryck och kryokonservering av den trådformiga cyanobakterien Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryoinjektionsteknik för genredigering i den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...