Name: fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00
Duration: 6 min 35 s
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这项工作得到了国家耳聋与其他交流障碍研究所（NIDCD）校内计划。

1。神经元转<ol><li>文化胚胎第18天（E18）大鼠海马神经元- D -聚赖氨酸包MatTek 35毫米的玻璃底菜 1 。 （DIV），在16-18天的体外转染的神经元，使用Clontech公司CalPhos哺乳动物转染试剂盒。首先，用1.5毫升培养基代替<a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">贝科改良Eagle培养基</a> （DMEM），每35毫米盘0.5小时之前转。 （步骤1.6）使用，保存在一个无菌的15毫升管的原培养液。 </li><li>混合使用无菌H 2 O（Clontech公司）和12.4μL2米钙的解决方案（Clontech公司）的总体积100μL的10μg的pEGFP - N1质粒DNA。 </li><li>从步骤1.2）中添加的混合物100μL2 ×哈佛商学院滴加而涡旋2 ×哈佛商学院在中等速度。 </li><li>让坐在混合物在室温下放置20分钟，然后添加步骤1.3）DMEM培养液培养的神经元最终混合物。 </li><li>为1-1.5小时，放入37℃培养箱中培养的神经元。 </li><li>删除磷酸钙介质中，然后用DMEM三次洗细胞。在返回培养皿中的孵化器，交流与原培养液DMEM培养基。 </li></ol> 2。在脊柱的FRAP实验<ol><li>用于转染后二至四天的FRAP实验的神经元。 </li><li>从35毫米的玻璃底菜更换培养液，立即加入预热Tyrode液，其中包含（毫米），HEPES 10 5 145氯化钠，氯化钾，葡萄糖10，甘氨酸0.005，2.6氯化钙和氯化镁2 1.3（用NaOH调整pH至7.4）。 </li><li>蔡司LSM 710共聚焦显微镜是用于FRAP实验。蔡司TempModule系统是用来控制温度（37℃），湿度和工作系统的CO 2（5％）。确保连接和一瓶水，这是用来平衡湿度，是装满了水，CO 2坦克。 </li><li>查找100 ×目标（αplan的复消色差透镜100 × / 1.46油）的转染成熟树突。如果在盘转染细胞稀疏，寻找所需的细胞与40 ×的目标（计划NEOFLUAR 40 × / 1.3油），然后切换到100 ×目标捕捉图像。 </li><li>使用5 ×光学变焦和256 × 256像素分辨率的图像一小段几个刺的枝蔓。要拍摄图像，使用额定转速（像素停留时间为3.15微秒）需要0.5秒完成扫描。针孔设置为2μm的获得较强的荧光。到图像时，尝试使用激光传输低，例如1-5％，以避免漂白的整个形象。 </li><li>选择感兴趣的脊椎。在我们的实验中，我们选择与他们的脊柱头部直径约1微米的蘑菇刺。 </li><li>为了做一个FRAP实验，漂白前5个控制影像，然后漂白脊柱利益标称100％激光传输的10倍[氩激光功率为30兆瓦，488激光线的50％（15毫瓦），和约3-4毫瓦，达到通过显微镜488激光线]，然后漂白后，立即捕捉了一系列的图像。在这个实验中，图像被捕获漂白后每15秒1秒。调整的时间间隔应根据不同的目标蛋白质和不同的实验设计（ 图1） 。 </li><li>保存图像。 </li></ol> 3。数据分析<ol><li>与ImageJ软件中打开图像。 </li><li>对齐使用对齐工具图像的堆栈 - ImageJ（“插件”→“栈洗牌”→“对齐堆栈片”→“翻译”和/或“刚体”），使脊柱的利益不浮换句话说 - 它仍然在同一位置上的图像。 </li><li>测量相对利益（F S）的脊椎，一个转，但漂白地区（对照组），在时间的推移图像和背景区域（F B）的荧光强度，使用ImageJ工具“力度V时间显示器”（ “插件“→”栈 - 洗牌“→”强度V时间显示器“）。控制区域可以是一个倍受关注的远端树突的一块。背景区是一个非荧光的地区。 </li><li>计算前（F C0）和（F C）漂白后，通过比较控制区的荧光光漂白率（R ）。 R = F C / F C0。 </li><li>目标脊柱的荧光强度（F）的规范如下： F =（F S - F B）/ R。 </li><li>曲线拟合Graphpad Prism软件一阶段的指数方程（ 图2）或官方所用的荧光强度的目标脊柱ř类似软件。 </li><li>计算移动的分数（F M）和不动的一小部分（一 ）由下列公式： F M = F∞/ F 0， 其中，F∞全面复苏后的荧光强度，F 0是前漂白的荧光强度。 F的第I = 1 - F 米。 </li></ol> 4。代表性的成果： 在这项研究中，我们执行一个成熟的海马神经元的FRAP实验。在18-22格，已形成了蘑菇刺。用我们的方法，在一个小区域的荧光强度的动态变化，如脊椎，可以被记录下来。 要分析的EGFP荧光恢复过程中，我们采取控制之前，漂白和5张1图像的每1在15秒漂白后立即第二。图像分辨率是足够的定量分析。标记的荧光蛋白的荧光恢复型材高度重复性。 我们还简要说明如何定义一个荧光蛋白的移动和静止的分数，使用ImageJ和Graphpad Prism软件。我们在这里展示的FRAP方法和分析，可以广泛应用于神经科学，细胞生物学等研究。 <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。FRAP EGFP荧光测量在脊柱从培养的海马神经元。红色箭头指示的漂白时间。照片代表前同一地区（预），0，1，5，10，15秒​​后漂白。字母S，C和B，分别标有脊柱，控制和背景区域。在实验过程中，神经元保持在37 ° C。比例尺，1微米。 <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。FRAP EGFP荧光曲线超过15秒的时间。绿线显示了原始的曲线;红线显示正常化的曲线。曲线上的点显示FRAP每隔1秒。一个阶段的指数方程拟合曲线。漂白前的平均荧光计为100％。在这个实验中，移动的比例（MF）是94％，在不动的分数（IF）为6％。

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	<li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines.">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li><li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins:+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca(2+)-ATPase+2.">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li><li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion.">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family.">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+analysis+of+binding:+proper+and+fitting.">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li></ol>

FRAP分析已被广泛使用在体内和体外1-2研究。这种技术通常利用GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="融合蛋白">融合蛋白</a> ，虽然它也可以用红藻融合蛋白3。这种分析是敏感的，可以用来描述GFP标记的蛋白质的流动性。 要产生有意义的FRAP分析，重要的是要避免不必要的漂白FRAP实验之前和期间。有两种方法来实现这一。首先，搜索和观察实验的神经元的过程要快。特别是，神经元与100X的目标很长一段时间的观察明显漂白的荧光。二，高的激光功率和频繁扫描，往往会增加漂白的可能性。因此，将需要计算在控制区域的漂白率，然后在实验地区的FRAP曲线正常化。正火的方法已被描述的协议（见步骤，细节为3.3-3.5）。 漂白步骤，也是确保获得良好FRAP结果的关键。在这个实验中，我们漂白利息的10倍，100％的激光传输的脊椎。这条件是足够的一个背景在一个固定的编制水平的脊柱荧光漂白的。因此，我们设置漂白后的荧光强度在0秒作为背景相同数量。根据在第一次扫描的速度，可能已经被检测到的荧光恢复大量感兴趣的蛋白质是流动性很强。 已经开发了许多荧光蛋白探针研究蛋白质动力学与FRAP。互补性办法，例如，使用photoactivatable GFP（PA - GFP的），或photoconvertible变种。连同FRAP还原技术，这些工具成为不可或缺的活细胞成像研究4-6。

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>35 mm glass-bottom dishes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek</td>
<td>P35GC-1.0-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>631312</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>6085-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM 710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss TempModule system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graphpad Prism software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Graphpad software</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons

FRAP已被用来量化GFP标记的蛋白质的流动性。使用一个强大的激励激光，一个GFP标记蛋白的荧光漂白，在感兴趣的区域。 GFP标记的来自该地区以外的的漂白蛋白扩散到感兴趣的区域时，该区域的荧光恢复。蛋白质的流动性进行了分析，通过测量荧光恢复率。这种技术可以用来描述蛋白质的流动性和周转率。 在这项研究中，我们对培养海马神经元（增强型绿色荧光蛋白）EGFP的载体。我们使用蔡司710共聚焦显微镜，光漂白的在一个单一的脊椎的绿色荧光蛋白的荧光信号，然后取时间的推移图像记录荧光漂白后恢复。最后，我们估计在刺的绿色荧光蛋白的移动和静止的分数的百分比，通过分析成像数据，使用ImageJ和Graphpad软件。 这FRAP协议显示了如何执行基本FRAP实验，以及如何对数据进行分析。

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Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP已被用来量化绿色荧光蛋白（GFP）标记在培养细胞中的蛋白质的流动性。我们研究分析了GFP的荧光漂白后恢复的百分比移动/静止的分数。在这项研究中，FRAP刺海马神经元。

漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘

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Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

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