Name: fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione (dell&#39;NIDCD) Programma Intramural.

1. Neuron trasfezione <ol><li> Cultura embrionale i neuroni di ratto giorno 18 (E18) dell&#39;ippocampo sulla poli-d-lisina rivestite MatTek da 35 mm con fondo di vetro piatti 1. Sul 16-18 giorni in vitro (DIV), i neuroni trasfezione utilizzando il kit CalPhos Transfection mammiferi Clontech. In primo luogo, sostituire il terreno di coltura con 1,5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">di coltura Dulbecco modificato Aquila Media</a> (DMEM) per 35 mm, piatto 0,5 ore prima della trasfezione. Salvare il supporto originale la cultura in un tubo sterile 15 ml per rivederlo (passo 1,6) uso. </li><li> Mix 10 mcg pEGFP-N1 DNA plasmidico con sterili H 2 O (Clontech) e 12,4 microlitri soluzione 2 M di calcio (Clontech) per un volume totale di 100 ul. </li><li> Aggiungere il composto a partire dal punto 1.2) a 100 l 2 × HBS goccia a goccia, mentre vortex 2 × HBS a velocità media. </li><li> Lasciate il composto a temperatura ambiente per 20 minuti e poi aggiungete il composto finale dal punto 1.3) in DMEM-incubate neuroni. </li><li> Mettete i neuroni indietro nel 37 ° C incubatore per 1-1,5 ore. </li><li> Rimuovere il fosfato contenenti calcio medio, quindi lavare le cellule con DMEM tre volte. Prima di restituire il piatto alla cultura, incubatore di cambio del mezzo DMEM con il terreno di coltura originale. </li></ol> 2. FRAP esperimento su una spina dorsale <ol><li> I neuroni sono utilizzati per l&#39;esperimento FRAP 2-4 giorni dopo la trasfezione. </li><li> Sostituire il terreno di coltura da 35 mm con fondo di vetro piatto, da subito l&#39;aggiunta di pre-riscaldato Soluzione Tyrode, che contiene (in mm) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Glucosio 10, glicina 0,005, CaCl2 2.6, e MgCl 2 1.3 (pH regolato a 7,4 con NaOH). </li><li> Un Zeiss LSM 710 microscopio confocale è utilizzato per l&#39;esperimento FRAP. Il sistema TempModule Zeiss è utilizzato per controllare la temperatura (37 ° C), l&#39;umidità e la CO 2 (5%) del sistema di lavoro. Assicurarsi che la CO 2 del serbatoio è collegato e la bottiglia d&#39;acqua, che viene utilizzato per bilanciare l&#39;umidità, si riempie di acqua. </li><li> Trova un dendrite transfettate maturo con l&#39;obiettivo × 100 (αplan-Apochromat 100 × / 1,46 olio). Se le cellule transfettate nel piatto sono sparse, ricerca di una cella desiderata con l&#39;obiettivo 40 × (Plan-Neofluar 40 × / 1,3 olio), e poi passare alla 100 × obiettivo di catturare le immagini. </li><li> Utilizzare 5 × zoom ottico e di una risoluzione di 256 × 256 pixel per l&#39;immagine di un breve brano di dendrite con spine diverse. Per catturare le immagini, utilizzare velocità nominale 9 (pixel tempo di sosta 3,15 msec) che prende 0,5 secondi per completare una scansione. Il foro stenopeico è impostato per 2μm di ottenere una forte fluorescenza. Quando si scattano immagini, tenta di utilizzare la trasmissione a bassa laser, per esempio 1-5%, per evitare photobleaching l&#39;intera immagine. </li><li> Selezionare la colonna vertebrale di interesse. Nel nostro esperimento, abbiamo scelto spine di funghi con diametro della colonna vertebrale la testa di circa 1 micron. </li><li> Per fare un esperimento FRAP, prendere 5 immagini di controllo prima dello sbiancamento, poi candeggina la colonna vertebrale di interesse 10 volte al valore nominale di trasmissione laser 100% [La potenza argon laser è 30 mW, con il 50% (15 mW) in linea 488 laser, e mW circa 3-4 arriva al microscopio attraverso la linea 488 laser], e quindi acquisire una serie di immagini subito dopo lo sbiancamento. Per questo esperimento, le immagini vengono catturate ogni 1 secondo per 15 secondi dopo lo sbiancamento. L&#39;intervallo di tempo dovrebbe essere regolata in base alle diverse proteine ​​target e diversi disegni sperimentali (Fig. 1). </li><li> Salvare le immagini. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Aprire le immagini con il software ImageJ. </li><li> Allineare la pila di immagini utilizzando lo strumento di allineamento (&#39;plugins&#39; → &#39;pile - mischiare&#39; → &#39;allineare le fette in pila&#39; → &#39;corpo rigido&#39; &#39;traduzione&#39; e / o) in ImageJ, in modo che la colonna vertebrale di interesse non galleggia , in altre parole - rimane nella stessa posizione sull&#39;immagine. </li><li> Misura relativa intensità di fluorescenza della colonna vertebrale di interesse (F s), una regione transfettate ma greggi (controllo), e una regione di fondo (F b) nelle immagini lasso di tempo, utilizzando lo strumento &#39;intensità v Tempo Monitor&#39; di ImageJ (&#39;plugin &#39;→&#39; pile - mischiare &#39;→&#39; intensità v Tempo Monitor &#39;). La regione di controllo potrebbe essere un pezzo di ben focalizzato dendrite distale. La regione sfondo è un non-fluorescente regione. </li><li> Calcolare il tasso photobleaching (r) confrontando la fluorescenza della regione di controllo prima (F c0) e dopo (F c) photobleaching. r = F c / F c0. </li><li> Normalizzare l&#39;intensità di fluorescenza della colonna di destinazione (F) come segue: F = (F s - F b) / r. </li><li> Curva adatta l&#39;intensità di fluorescenza della colonna vertebrale bersaglio con una sola fase equazione esponenziale del software Prism GraphPad (Fig. 2) o Other software simili. </li><li> Calcolare la frazione mobile (f m) e la frazione di immobile (f) dalle seguenti equazioni: f m = ∞ F / F 0, dove F ∞ è l&#39;intensità di fluorescenza dopo il recupero completo, e F 0 è l&#39;intensità di fluorescenza prima photobleaching. f i = 1 - lettera f m. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: In questo studio, noi dobbiamo fare un esperimento su FRAP maturo neuroni dell&#39;ippocampo. A 18-22 DIV, spine funghi sono già formate. Utilizzando il nostro metodo, i cambiamenti dinamici della fluorescenza in una regione piccola, come una spina dorsale, può essere registrato. Per analizzare il processo di recupero di fluorescenza EGFP, prendiamo 5 immagini come controlli prima dello sbiancamento e poi 1 immagine ogni 1 secondo subito dopo lo sbiancamento per 15 secondi. La risoluzione dell&#39;immagine è sufficiente per l&#39;analisi quantitativa. I profili di recupero di fluorescenza di tag proteine ​​fluorescenza sono altamente riproducibili. Abbiamo anche brevemente illustrato come definire le frazioni mobile e immobile di una proteina a fluorescenza, utilizzando ImageJ e software Prism GraphPad. Il metodo FRAP e analisi mostriamo qui può essere ampiamente utilizzato nel campo delle neuroscienze, biologia cellulare e altri studi. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. FRAP misure di fluorescenza EGFP in una spina da un neurone dell&#39;ippocampo colta. Le frecce rosse indicano il tempo di photobleaching. Fotografie rappresentano la stessa area prima (Pre) e 0, 1, 5, 10, 15 secondi dopo photobleaching. La regione del controllo della colonna vertebrale, e lo sfondo sono contrassegnate con le lettere S, C e B, rispettivamente. I neuroni sono stati mantenuti a 37 ° C durante l&#39;esperimento. Scala bar, 1 micron. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Curve FRAP di fluorescenza EGFP nel corso di un periodo di 15 secondi. La linea verde mostra la curva originale, la linea rossa indica la curva normalizzata. I puntini sulle curve mostrano il FRAP ogni 1 secondo. Le curve sono stati montati da equazioni esponenziali monofase. La fluorescenza media prima photobleaching è stato contato come 100%. In questo esperimento, la frazione mobile (MF) è del 94% e la frazione di immobile (IF) è del 6%.

<ol>
	<li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines.">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li><li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins:+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca(2+)-ATPase+2.">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li><li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion.">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family.">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+analysis+of+binding:+proper+and+fitting.">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Analisi FRAP è stato ampiamente utilizzato in vivo e in vitro 1-2 studi. Questa tecnica utilizza comunemente GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Proteina di fusione">proteine ​​di fusione</a> , anche se potrebbe anche usare proteine ​​di fusione alga rossa 3. Questa analisi è sensibile e può essere utilizzato per caratterizzare la mobilità dei GFP-tagged proteine. Per produrre analisi significativa FRAP, è importante evitare inutili photobleaching prima e durante l&#39;esperimento FRAP. Ci sono due modi per raggiungere questo obiettivo. In primo luogo, la procedura per ricercare e osservare il neurone sperimentale dovrebbe essere veloce. In particolare, l&#39;osservazione di neuroni con un obiettivo 100X per lungo tempo schiarisce in modo significativo la fluorescenza. In secondo luogo, il potere e la scansione laser ad alta frequenza spesso aumentano la possibilità di photobleaching. Quindi, sarà necessario per calcolare il tasso photobleaching in una zona di controllo e poi normalizzare la curva FRAP nella regione sperimentale. Il metodo di normalizzazione è stato descritto nel protocollo (vedere il passaggio 3,3-3,5 per i dettagli). Il passo fotodecolorazione è inoltre fondamentale per garantire buoni risultati FRAP. In questo esperimento, abbiamo candeggina la colonna vertebrale di interesse 10 volte al 100% di trasmissione laser. Questa condizione è sufficiente per sbiancare la fluorescenza di una spina dorsale a livello di fondo in un preparato fisso. Così, abbiamo fissato l&#39;intensità di fluorescenza allo stesso numero da sfondo a 0 secondi dopo photobleaching. A seconda della velocità della prima scansione, una quantità significativa di recupero fluorescenza potrebbe essere già rilevato quando la proteina di interesse è molto mobile. Molte sonde proteina fluorescente sono stati sviluppati per studiare la dinamica delle proteine ​​con FRAP. Un approccio complementare è, per esempio, per utilizzare photoactivatable GFP (GFP-PA), o varianti photoconvertible. Insieme con la tecnica FRAP, questi strumenti stanno diventando indispensabile per gli studi di imaging cellulare dal vivo 4-6.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>35 mm glass-bottom dishes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek</td>
<td>P35GC-1.0-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>631312</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>6085-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM 710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss TempModule system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graphpad Prism software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Graphpad software</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons

FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità dei GFP-tagged proteine. Utilizzando un laser forte eccitazione, la fluorescenza di una proteina GFP-tagged è sbiancato nella regione di interesse. La fluorescenza della regione recupera quando il greggio GFP-tagged proteine ​​al di fuori della regione diffonde nella regione di interesse. La mobilità della proteina viene poi analizzata misurando il tasso di fluorescenza di recupero. Questa tecnica potrebbe essere usata per caratterizzare la mobilità proteine ​​e tasso di turnover. In questo studio, esprimiamo la (enhanced green fluorescent protein) vettore EGFP in colture di neuroni dell&#39;ippocampo. Utilizzando il microscopio confocale Zeiss 710, abbiamo photobleach il segnale di fluorescenza della proteina GFP in una sola colonna vertebrale, e poi prendere le immagini lasso di tempo per registrare il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Infine, si stima la percentuale di frazioni mobile e immobile della GFP in spine, analizzando i dati di imaging con ImageJ e software GraphPad. Questo protocollo FRAP mostra come eseguire un esperimento di base FRAP e come analizzare i dati.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità di Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteine ​​in cellule in coltura. Abbiamo esaminato le frazioni mobile / immobile della GFP, analizzando la percentuale di recupero di fluorescenza dopo photobleaching. In questo studio, FRAP è stato effettuato a dorso di neuroni dell&#39;ippocampo.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Ricerca

Neuroscienze

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali