Name: fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке Национального института глухоты и других расстройств связи (NIDCD) Внутренние программы.

1. Нейрон трансфекции <ol><li> Культуры эмбриональных крыс день 18 (E18) нейронов гиппокампа на поли-D-лизин покрытием Маттек 35-мм со стеклянным дном блюда 1. На 16-18 дней в пробирке (DIV), трансфекции нейронов использованием Clontech CalPhos млекопитающих Kit трансфекции. Во-первых, заменить культуральной среде с 1,5 мл <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">изменения Eagle Дульбеко среднего</a> (DMEM) в 35-мм блюдо 0,5 часа до трансфекции. Сохраните оригинальную питательную среду в стерильные 15 мл трубку для последующего использования (шаг 1,6) использования. </li><li> Смешайте 10 мкг pEGFP-N1 ДНК плазмиды стерильной H 2 O (Clontech) и 12,4 мкл 2 М раствор кальция (Clontech) до общего объема 100 мкл. </li><li> Добавить смесь из шага 1.2) до 100 мкл 2 × HBS по каплям при вортексе 2 × HBS на средней скорости. </li><li> Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем добавить конечной смеси с шага 1.3) в DMEM-инкубировали нейронов. </li><li> Положите нейронов обратно в 37 ° C инкубатора в течение 1-1,5 часов. </li><li> Удалить из фосфата кальция среде, содержащей, затем промыть клетки с DMEM три раза. Перед возвращением культуры блюдо инкубатор, обмен среде DMEM с оригинальным питательной среды. </li></ol> 2. FRAP эксперимент по позвоночнику <ol><li> Нейроны используются для FRAP эксперимент двух до четырех дней после трансфекции. </li><li> Замените культуральной среде с 35-мм со стеклянным дном тарелку, добавив, немедленно подогретого Tyrode Решение, которое содержит (в мМ) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Глюкоза 10, Глицин 0,005, CaCl 2 2.6 и MgCl 2 1.3 (рН до 7,4 с NaOH). </li><li> Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии используется для FRAP эксперимента. Система Zeiss TempModule используется для контроля температуры (37 ° С), влажности и CO 2 (5%) из работающей системы. Убедитесь, что CO 2, танк подключен и бутылку воды, которая используется для балансировки влажности, заполнен водой. </li><li> Найти трансфицированных зрелых дендритных с 100 × цели (αplan-Apochromat 100 × / 1,46 масла). Если трансфекции клеток в блюдо редкие, поиск нужную ячейку с 40 × цель (план-NEOFLUAR 40 × / 1,3 масла), а затем переключиться на 100 × цель для захвата изображений. </li><li> Используйте 5 × оптический зум и 256 × 256 пикселей на изображение небольшой фрагмент дендрита с несколькими шипами. Для захвата изображения, использовать номинальной скорости 9 (пиксель время задержки 3,15 мкс), который занимает 0,5 секунды, чтобы закончить проверку. Обскуры установлен в 2 мкм, чтобы получить сильную флуоресценцию. При съемке изображений, попробуйте использовать низкие передачи лазера, например, 1-5%, чтобы избежать фотообесцвечивания всего изображения. </li><li> Выберите позвоночника интересов. В нашем эксперименте мы выбираем гриб шипами с позвоночником головы диаметром ~ 1 мкм. </li><li> Для этого FRAP эксперимент, возьмите 5 изображений контроль до отбеливания, то отбеливатель позвоночника интерес в 10 раз при номинальной 100% лазерной передачи [власти аргонового лазера составляет 30 мВт, при этом 50% (15 мВт) в 488 лазерных линий, а примерно 3-4 мВт достигает микроскопом через 488 лазерных линий], а затем захват серии изображений сразу после отбеливания. Для этого эксперимента, что изображения будут захвачены каждую 1 секунду в течение 15 секунд после отбеливания. Промежуток времени должен быть скорректирован в зависимости от различных ориентации белков и различных экспериментальных конструкций (рис. 1). </li><li> Сохранение изображений. </li></ol> 3. Анализ данных <ol><li> Открытие изображений с ImageJ программного обеспечения. </li><li> Выровняйте стопку фотографий с помощью инструмента выравнивания (&#39;стеки - перетасовка &quot;,&quot; плагины &quot;→ →&quot; выровнять ломтики в стеке&#39; → «перевод» и / или «твердого тела») в ImageJ, так, чтобы позвоночник интерес не плавает , другими словами - он остается в том же положении на изображении. </li><li> Мера относительной интенсивности флуоресценции позвоночника интереса (F ы), трансфицированных но небеленой регионе (контроль), и фона области (F б) в образах промежуток времени, используя инструмент &quot;Интенсивность V Time Monitor &#39;из ImageJ (&quot; плагинов &#39;→&#39; стеки - перетасовка &#39;→&#39; Интенсивность V Time Monitor &quot;). Контроль региона может быть частью целенаправленной дистальных дендрита. Фон регионе не является люминесцентная регионе. </li><li> Рассчитать фотообесцвечивания ставка (г), сравнивая флуоресценции контрольного региона до (F c0) и после (F в) фотообесцвечивания. г = F C / F с0. </li><li> Нормализация интенсивности флуоресценции целевой позвоночника (F) следующим образом: F = (F ы - F б) / r. </li><li> Кривая соответствует интенсивности флуоресценции целевой позвоночника с однофазной экспоненциальным уравнением программного обеспечения Призма GraphPad (рис. 2) или КетеГ подобного программного обеспечения. </li><li> Рассчитать мобильных фракции (е м) и неподвижные фракции (е я) следующими уравнениями: F M = F ∞ / F 0, где F ∞ является интенсивность флуоресценции после полного восстановления, а F 0 является интенсивность флуоресценции до фотообесцвечивания. F = 1 - е м. </li></ol> 4. Представитель Результаты: В этом исследовании мы проводим эксперимент по FRAP зрелых нейронов гиппокампа. На 18-22 DIV, грибы шипы уже сформировались. Используя наш метод, динамические изменения интенсивности флуоресценции в небольшой области, например, позвоночника, могут быть записаны. Для анализа флуоресценции процесс восстановления EGFP, мы берем 5 изображений в качестве контроля перед отбеливанием, а затем 1 изображение каждые 1 секунды сразу после отбеливания в течение 15 секунд. Разрешение изображения достаточно для количественного анализа. Флуоресценции профилей восстановления меченых флуоресценции белков высокой воспроизводимостью. Мы также кратко показать, как определить подвижные и неподвижные доли флуоресценции белка, используя ImageJ и GraphPad Призма программного обеспечения. Метод FRAP и анализа мы показываем здесь, могут быть широко использованы в неврологии, клеточной биологии и других исследований. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. FRAP измерения флуоресценции EGFP в позвоночнике от культурных гиппокампа нейрона. Красные стрелки указывают время фотообесцвечивания. Фотографии представляют той же области до (Pre) и 0, 1, 5, 10, 15 секунд после фотообесцвечивания. Отделе позвоночника, контроль и фона, помечены буквами S, C и B, соответственно. Нейроны были сохранены при 37 ° С в течение эксперимента. Шкала бар, 1 мкм. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. FRAP кривых флуоресценции EGFP в течение 15-секундного периода. Зеленая линия показывает оригинальной кривой, красная линия показывает нормированный кривой. Точками на кривых показывают FRAP каждую 1 секунду. Кривые были установлены на одну фазу показательные уравнения. Средний флуоресценции до фотообесцвечивания считался 100%. В этом эксперименте мобильных фракции (MF) составляет 94%, а неподвижные фракции (ИФ) составляет 6%.

<ol>
	<li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines.">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li><li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins:+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca(2+)-ATPase+2.">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li><li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion.">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family.">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+analysis+of+binding:+proper+and+fitting.">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

FRAP анализ был широко используются в естественных условиях и в пробирке 1-2 исследований. Эта техника широко использует GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Fusion белка">слитых белков</a> , хотя она может также использовать красные водоросли белков слияния 3. Этот анализ чувствительны и могут быть использованы для характеристики мобильности GFP с метками белков. Для получения полноценного анализа FRAP, важно, чтобы избежать ненужных фотообесцвечивания до и во время FRAP эксперимента. Есть два пути для достижения этого. Во-первых, процесс поиска и наблюдения экспериментальных нейрон должен быть быстрым. В частности, наблюдения нейронов с 100X цель в течение длительного времени значительно отбеливает флуоресценции. Во-вторых, высокая мощность лазерного сканирования и частые часто увеличивают возможность фотообесцвечивания. Таким образом, необходимо будет рассчитать фотообесцвечивания ставка в контрольной области, а затем нормализовать FRAP кривой в экспериментальной области. Нормализации метод был описан в протоколе (см. шаг 3.3-3.5 право). Фотообесцвечивания шаг также решающее значение для обеспечения хороших результатов FRAP. В этом эксперименте мы отбеливателя позвоночника интерес в 10 раз при 100 передачи лазерного%. Это условие является достаточным, чтобы отбелить флуоресценции позвоночника к фоновому уровню в фиксированном подготовки. Таким образом, мы устанавливаем интенсивности флуоресценции на тот же номер в качестве фона на 0 секунд после фотообесцвечивания. В зависимости от скорости первого сканирования, значительное количество флуоресценции восстановления, возможно, уже обнаружена, когда белок является очень мобильны. Многие флуоресцентных зондов белка были разработаны для изучения динамики белков с FRAP. Дополнительный подход является, например, использовать фотоактивируемых GFP (PA-GFP), или photoconvertible вариантов. Вместе с FRAP техники, эти инструменты становятся необходимыми для живой клетки диагностическая визуализация 4-6.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>35 mm glass-bottom dishes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek</td>
<td>P35GC-1.0-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>631312</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>6085-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM 710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss TempModule system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graphpad Prism software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Graphpad software</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons

FRAP была использована для количественной оценки подвижности GFP с метками белков. Использование сильного лазерного возбуждения флуоресценции GFP с метками белка отбеливается в области интереса. Флуоресценции области восстанавливается при небеленой GFP с метками белка из-за пределов региона диффундирует в область интересов. Подвижность белка затем анализируется путем измерения флуоресценции скорость восстановления. Этот метод может быть использован для характеристики подвижности белка и текучести кадров. В этом исследовании, мы выражаем (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) EGFP вектор в культуре нейронов гиппокампа. Использование Zeiss 710 конфокальной микроскопии, мы photobleach флуоресценции сигнал GFP белка в одном позвоночника, а затем получать изображения промежуток времени для записи флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Оценим, наконец, процент подвижных и неподвижных доли GFP в шипы, на основе анализа данных с использованием изображений ImageJ и GraphPad программного обеспечения. Этот протокол FRAP показано, как выполнять основные эксперимент FRAP, а также, как анализировать данные.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP была использована для количественного мобильность Зеленый флуоресцентный белка (GFP), помеченные белков в культуре клеток. Мы рассмотрели мобильных / неподвижные доли GFP путем анализа флуоресценции процент выздоровления после фотообесцвечивания. В этом исследовании, FRAP была выполнена на шипы нейронов гиппокампа.

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; У пожилых нейронов гиппокампа

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Измеряя эндоцитоза синаптических пузырьков в культивированный Нейроны гиппокампа

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...