Name: fish for pre-implantation genetic diagnosis
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00
Duration: 7 min 34 s
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1. Lisi e diffondere un nucleo da una biopsia di blastomeri <ol><li> Buffer di lisi cellulare per diffusione di cellule (0,2% Tween20 di 0,01 M HCl, pH 2,0) deve essere preparato 24 ore di anticipo e conservati a -20 ° C. La preparazione di 100 ml e filtrare 20 ml in un contenitore sterile da 30 ml universale usando una siringa da 20 ml sterile e filtro siringa. Dispensare 1 ml di aliquote in 15/10 1,7 mL microcentrifuga sterili, chiudere ed etichettare le provette prima del congelamento. Si raccomanda di avere due partite diverse è uso, il nuovo lotto e il lotto precedente, che è stato testato e può essere utilizzato se il nuovo lotto non è soddisfacente. </li><li> Sbrinare il tampone di lisi a temperatura ambiente 30 minuti prima della procedura di biopsia. Ai fini pratici, la temperatura di esercizio sarà tra temperatura ambiente e temperatura della mano. </li><li> Punteggio ottenuto un piccolo cerchio (circa 5 mm di diametro) sul lato inferiore di una ammina rivestite scorrimento (ad esempio Genetix) utilizzando una penna di diamante e pre-etichetta la diapositiva con il numero del caso, numero di diapositiva unico, e data la biopsia. Utilizzare un vetrino separato per ogni blastomero in ordine numerico, e l&#39;etichetta con il numero degli embrioni. Vetrini devono essere etichettati con una matita dura come 4H, e &quot;cancellati&quot; con un guanto in lattice per rimuovere la polvere di grafite. </li><li> Mettere un piccolo volume di tampone di lisi all&#39;interno del cerchio. </li><li> Trasferire il blastomero biopsia nel buffer di lisi. Se necessario aggiungere tampone di lisi all&#39;interno del cerchio fino a quando la cellula comincia a lisare, la cellula deve lisare completamente e il citoplasma disperdersi prima che si asciughi buffer. </li><li> Osservare il nucleo di modo che esso rimanga all&#39;interno del cerchio e non è perduto, se la cella non ha un nucleo o ha nuclei multipli, biopsia un&#39;altra cella. </li><li> Lasciare il vetrino asciugare all&#39;aria a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Ibridazione in situ di un nucleo singolo blastomero <ol><li> Preparare una serie di etanolo (70, 90 e 100%) costituita in acqua distillata sterile. </li><li> Attivare e impostare il blocco caldo (ad esempio Hybaid Omnislide o Vysis Hybrite) a 75 ° C. </li><li> Sonde di sbrinamento, vortice, e centrifuga. I reagenti devono essere assistito e verificato di essere corretto prima che compongono la miscela della sonda. Volumi pipetta come specificato dal costruttore per costituire la miscela della sonda in una provetta da microcentrifuga 0,65 ml sterile e vortex e centrifugare prima dell&#39;uso. Il volume totale della miscela sonda dovrebbe essere sufficiente per consentire 2 microlitri per ogni nucleo da testare e arrotondato al più vicino 10 microlitri per consentire un margine di sicurezza. </li><li> Prelavaggio i vetrini in vaschette Coplin con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M di NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i vetrini due volte in acqua distillata sterile. </li><li> Disidratare le diapositive con la serie di etanolo (70, 90 e 100%) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente e aria secca. Garantire scivoli sono completamente immersi e se la polvere di grafite galleggia in superficie, assorbire con un panno pulito. </li><li> Registrare la posizione del nucleo all&#39;interno del cerchio da visualizzare con un microscopio a contrasto di fase. </li><li> Disidratare con il 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente e aria secca. </li><li> Applicare 2 l di miscela della sonda, e coprire con un 9 x 9 millimetri coprioggetto (un quarto di un 18 millimetri x 18 n.1 coprioggetto). </li><li> Sigillare i bordi del coprioggetto con gomma cemento (ad esempio Mucca Gum, correzione di mucca). </li><li> Codenature i vetrini su un blocco calda a 75 ° C per 5 minuti, e poi ibridare le diapositive durante la notte (16-20 ore) in una camera umidificata a 37 ° C. Mescola sonda che è interamente costituita da sonde centromero (ad esempio per casi legato al sesso) darà un risultato soddisfacente dopo 60 min di ibridazione. </li><li> Preparare un bagno d&#39;acqua con sufficiente vaschette Coplin e calore a 71 ° C. </li><li> Preparare una 0.4x citrato standard di soluzione salina (CSD), soluzione di lavaggio stringente (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M di NaCl, 6 mm C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) e di calore nel bagno d&#39;acqua. </li><li> Dispensare 50 ml di lavaggio stringente per Coplin vaso richiesti e controllare che la temperatura è 71 ° C immediatamente prima dell&#39;uso con un termometro pulito. </li><li> Rimuovere con cura il mastice di ogni diapositiva e risciacquare il coprioggetto utilizzando 4x SSC/0.05 Tween20% (pH 7,0) a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le diapositive nel lavaggio 0.4x SSC stringenti a 71 ° C per 5 min. Lavare non più di 6 diapositive per vaschetta Coplin. </li><li> Lavare i vetrini in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Se la miscela contiene sonda sonda indirettamente etichettati (s), scaricare le diapositive del liquido in eccesso e applicare 20 l di anticorpo fluorescente coniugato con un 20 x 20 mm quadrati di Parafilm. </li><li> Incubare in una camera umidificata a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Rimuovere il Parafilm e lavare una volta in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Lavare due volte per 2 min in PBS, unt temperatura ambiente e drenare le diapositive. </li><li> Applica 6 ml di DAPI / Vectashield (160 ng di 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato in 1 ml di terreno Vectashield montaggio, Vector Laboratories) ad un 22 x 22 mm cod. 0 coprioggetto e invertire il vetrino sopra il coprioggetto. </li><li> Blot e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. </li></ol> 3. Analisi utilizzando un microscopio a fluorescenza opportunamente attrezzato di appositi filtri per la sonde utilizzate. <ol><li> Segnali punteggio visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a fluorescenza e singoli filtri passa-banda per ogni fluorocromo nel saggio. Ogni nucleo dovrebbe essere segnato da due analisti. Una regola generale dovrebbe portare al gol di un segnale unico in cui due segnali molto vicine tra loro sono meno di un dominio (segnale di larghezza) a parte, tuttavia, il giudizio sulla base dell&#39;esperienza deve essere esercitato per interpretare i segnali di varie dimensioni, intensità, e la separazione. </li><li> Utilizzare software di imaging (ad esempio Iside, MetaSystems, Altlußheim, Germania; CytoVision, Genetix) per catturare un&#39;immagine del nucleo per la conferma della diagnosi visiva, e per la archiviazione delle immagini come parte di un piano di assicurazione della qualità da laboratorio. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Metafase e nuclei interfasici da colture di linfociti del sangue periferico devono essere esaminati per verificare che le sonde selezionati sono specifici per traslocazione dei cromosomi, informativo per i punti di interruzione (le sonde subtelomere dovrebbero ibridarsi solo ai segmenti traslocato e la sonda centromero (s) al centrica segmento (s)) e dei segnali in nuclei interfasici deve essere brillante e discreto. Segnando il numero di segnali per ogni sonda in 100 nuclei interfasici da ogni partner si consiglia di valutare l&#39;efficacia del test. In questo caso 2 segnali sono stati segnati nel 95% -99% dei nuclei per ciascuna sonda. La figura 1 mostra una metafase e nucleo interfase da una preparazione per una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9. Segnali in nuclei interfasici da blastomeri dell&#39;embrione deve essere brillante e discreto e valutato con separato filtri passa banda per i colori utilizzati. La Figura 2 mostra un nucleo blastomero con un modello normale segnale (2 copie per tutti i loci testati) coerenti con un corredo cromosomico normale o bilanciato per il cromosoma 5 e 9, e un nucleo con un modello di segnale anomalo in linea con un prodotto della traslocazione sbilanciata che ha monosomia (una copia) per il segmento del cromosoma 5 traslocato e trisomia (3 copie) per il segmento traslocato del cromosoma 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Uno spread metafase e un nucleo interfase preparati da colture di linfociti del sangue periferico da un portatore di una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9 con punti di interruzione in 5p14.3 9p24.1 e:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +);. 9) 5ptel48-, 9ptel30 + ( Sonde FISH sono stati selezionati per entrambi i segmenti traslocato (5p14.3 → 5pter, rosso Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) e il segmento centrica del cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, blu Abbott CEP 9 alfa satellite SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Segnali Figura 2. Nuclei in interfase blastomero dal primo giorno-3 embrioni catturate utilizzando un filtro diverso per ogni fluorocromo e uniti per formare un&#39;immagine composita. (A) due segnali per ogni sonda indicare due copie di ogni luogo, che è coerente con un complemento normale o bilanciato per traslocazione dei cromosomi. (B) Un segnale rosso, tre segnali verdi e due segnali blu che indica una copia del traslocato segmento del cromosoma 5, tre copie del segmento di traslocazione del cromosoma 9 e due copie del segmento centrica del cromosoma 9, che è coerente con adiacente -1 segregazione della traslocazione determinando un prodotto non bilanciato con monosomia per 5p14.3 → 5pter e la trisomia per 9p24.1 → 9pter.

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R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyomapping,+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes.">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;applicazione di ibridazione in situ fluorescente (FISH) in una singola cellula embrionale (blastomero) presenta sfide particolari sia nel aspetti pratici e per l&#39;interpretazione del modello del segnale. La cella biopsia deve essere diffuso all&#39;interno di una zona di pre-definito sulla diapositiva in modo da facilitare la sua localizzazione seguenti pesci; estrema cura deve essere presa per assicurare che la cellula subisce una lisi, che il citoplasma è stato disperso, e che il nucleo è visibile e intatto, e, come la diagnosi dipende dai risultati di questa singola cella, segnando rigorose e interpretazione linee guida dovrebbero essere applicate. Tuttavia, in mani esperte, FISH è una tecnica robusta per la pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) nella pratica clinica. Il principio della PGD mediante FISH è che l&#39;obiettivo sonde specifiche di DNA marcati con fluorocromi diversi o apteni possono essere usati per rilevare il numero di copie di loci specifici, e quindi di rilevare lo squilibrio dei cromosomi associati a segregazione meiotica di riarrangiamenti cromosomici (1), tra cui robertsoniane traslocazioni, traslocazioni reciproche, inversioni, e riarrangiamenti complessi (2). PESCE può anche essere usato per selezionare gli embrioni femminili nelle famiglie con X-linked malattia, per cui non esiste nessuna mutazione specifica di test (3, 4). Più controverso, PESCE è stato utilizzato anche per lo screening per aneuploidie dei cromosomi sporadici al fine di cercare di migliorare l&#39;efficienza di riproduzione assistita (5, 6), ma il valore predittivo di questo test utilizzando FSIH è probabile che sia inaccettabilmente basso nella maggior parte delle persone mani e non è raccomandato per uso clinico di routine (7). Questo articolo si concentra sugli aspetti tecnici e le limitazioni della FISH applicata alla clinica cella singola diagnosi. Metodi di diffusione e di fissaggio blastomeri singolo includono metanolo / acido acetico (5, 8), Tween / HCl (9), e una combinazione di Tween / HCl e metanolo / acido acetico (10). Le variazioni includono il trattamento ipotonico delle cellule prima di diffondere e / o pepsina ed il trattamento paraformaldeide dopo la fissazione. Il metodo deve essere opportunamente convalidato per il laboratorio (14). Il Tween / HCl metodo è descritto in dettaglio in questo articolo. Il Tween / HCl metodo è tecnicamente semplice e altamente riproducibile in diversi laboratori. Questo metodo può essere utilizzato per preparare singoli nuclei per la diagnosi FISH della determinazione del sesso e riarrangiamenti cromosomici con accettabile accuratezza diagnostica (7). Mescola sonda può combinare direttamente etichettati e indirettamente sonde marcate, e le sonde di diversi produttori. Sonde per conoscere regioni cromosomiche polimorfici (11, 12), o quelli noti a cross-ibridare in modo significativo con altri cromosomi (13) dovrebbe essere evitata, anche se può essere utilizzato se dimostrato di essere appropriate e specifiche per la PGD da test prima su entrambi i partner riproduttivo . Fluorocromi disponibile / apteni e le strategie per sonde discriminanti sono le seguenti: Texas Red (TR), isotiocianato di fluorescina (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sonde biotinilato rilevati con TR-avidina, coniugati con avidina, o Cy-5 streptavidina (visualizzato per mezzo di un filtro FarRed), un mix di sonde rosso e verde per la produzione di un segnale giallo, un secondo round di ibridazione e di un terzo colore creato catturando in sequenza di SpectrumOrange utilizzando un TexasRed e un filtro SpectrumGold). Un insieme sonda contenente tre sonde, specifici per le regioni del centromero i cromosomi X e Y e autosoma uno, è raccomandato per la determinazione del sesso (14), la sonda autosomica viene utilizzato per stabilire ploidia e quindi a distinguere tra X trisomia (2n, 47 , XXX) e triploidia (3n, 69, XXX), e tra tetrasomia X (48, XXXX) e tetraploidia (4n, 92, XXXX). Una sonda applicata in tipico di questa impostazione è il mix AneuVysion Abbott contenenti alpha-satellite X, Y, e 18; questo set sonda ha dimostrato di avere un tasso di polimorfismo molto basso, e quindi pre-trattamento work-up dei partner riproduttivo non è necessaria (14). Il mix di sonda per qualsiasi riordinamento specifici devono: Idealmente contenere sonde almeno sufficiente a rilevare tutti i prodotti attesi del riassetto con squilibrio cromosomico. Se ciò non fosse possibile, la sonda si mescola in cui i prodotti non rilevati sbilanciato sono stati valutati per essere non vitali in una gravidanza riconoscibile e possono avere prevalenza molto bassa può essere accettabile (14). Essere testato su colture metafasi di linfociti da entrambi i partner riproduttivo. Almeno dieci diffonde metafase devono essere esaminati per la specificità della sonda, polimorfismi e cross-ibridazione, e, per il vettore riarrangiamento cromosomico, per garantire che le sonde ibridano come previsto ai diversi segmenti del riassetto. Inoltre, almeno 100 nuclei interfasici da questi preparati dovrebbero essere segnati per valutare la specificità del segnale, la luminosità e discretezza (14). Commercial set sonda PGS sono disponibili (ad esempio Abbott MultiVysion PB o PGT), intese a promuovere l&#39;cromosomi più frequentemente trovato per essere aneuploidi in prodotti del concepimento, e composta da una singola sonda per cromosoma mirati. In genere il nucleo può avere una seconda ibridazione con sonde per i cromosomi supplementari destinate a fornire un test per i cromosomi 13, 15, 16, 18, 21, 22, e XY (14). Il valore predittivo di questo test utilizzando la diffusione e la tecnica FISH qui descritto è probabile che sia inaccettabilmente basso nelle mani di molte persone e non è raccomandato per l&#39;uso clinico di routine (7, 15). Tecniche come ibridazione genomica comparativa (CGH) applicata a singole cellule sono in grado di testare per il numero di copie di ogni cromosoma (Wilton et al. 2001), e l&#39;utilizzo di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) array e analisi quantitativa (Wells et al . 2008) o genotipizzazione &quot;karyomapping&quot; (Handyside et al. 2009) sono promettenti tecniche alternative per rilevare aneuploidie dei cromosomi. Tuttavia, il limite di risoluzione e precisione lo sbilanciamento segmento rimangono incerte ed è probabile che PESCE continuerà ad essere la tecnica di scelta per i riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono piccoli segmenti.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hydrochloric Acid, 2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>101254H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride, 5Kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>443827W</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride, 250g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>26764.232</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>102494C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>10203 4B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide Pellets, 500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28245.265</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween20, 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>663684B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, 2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>8.18760.2500</td>
<td>Duty Paid</td>
</tr>
<tr>
<td>Tri-Sodium Citrate, 5Kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>27833.363</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cow Gum, 250mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cow Proofings Ltd.</td>
<td>No longer available</td>
<td>Old stocks can still be found in art shops</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI/Antifade ES, 0.125&mu;g/mL, 500ul</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytocell</td>
<td>DES500L</td>
<td>150&mu;l vial rec&#x2019;d with each Cytocell TEL Probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Nail Varnish, 12mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boots</td>
<td>10088316001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amine-coated Slides, 25</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>K2615</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI, 0.1mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield, 10mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas-Red-avidin, 0.001mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>A-2016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITC-avidin, 0.001mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>A-2011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Streptavidin, 0.001mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>PA45001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thistle Scientific</td>
<td>AX-MCT-175-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thistle Scientific</td>
<td>AX-MCT-060-C-CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30ml Universal Containers, box of 400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sterilin</td>
<td>128B</td>
<td>Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR VWR VWR</td>
<td>451-0107 451-3112 451-3111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plugged Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PMK-300-052R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wild Heerbrugg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissues, 100boxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NHS SUPPLY CHAIN</td>
<td>MJT058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metal Culture Trays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Melamine Trays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>682-009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth Pipette Mouthpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>HAE3700 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Filter, 0.2&mu;m pore size, 25mm diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>FDM-340-010U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diamond Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>818-0021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Block for Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Hybaid</td>
<td>HBOSBB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Roll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NHS SUPPLY CHAIN</td>
<td>MJT004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schieferdecker Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-9313</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-9331</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps, Fine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>232-2123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps, Blunt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>232-2113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1000mL Beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>213-1642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Contrast Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>E200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibre-free Blotting Cards, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (Raymond Lamb)</td>
<td>SDE1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1mL Syringe, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NHS Supply Chain</td>
<td>FWC045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1mL Pipette Tip, 10racks of 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thistle Scientific</td>
<td>AX-T-1000-C-L-R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LEEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Waterbath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grant</td>
<td>W22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcohol Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various sources available</td>
</tr>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jenway</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Electrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>662-1759</td>
<td>BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305</td>
</tr>
<tr>
<td>Heated Stirrer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bibby</td>
<td>HC502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1mL Pasteur Pipettes, box of 500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>PIP4202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm, 50mm x 75m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>291-1214</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fish for pre-implantation genetic diagnosis

Diagnosi pre-impianto genetico (PGD) è un&#39;alternativa stabilito per la diagnosi prenatale, e coinvolge la selezione pre-impianto degli embrioni da una coorte generato dalla tecnologia di riproduzione assistita (ART). Questa selezione può essere richiesto a causa di malattie monogeniche familiare (per esempio la fibrosi cistica), o perché uno dei partner porta un riarrangiamento cromosomico (ad esempio un doppio senso traslocazione reciproca). PGD ​​è disponibile per coppie che hanno avuto precedenti figli affetti, e / o nel caso di riarrangiamenti cromosomici, aborti ricorrenti o infertilità. Ovociti aspirati stimolazione ovarica seguito vengono fecondati in vitro da parte in immersione nel liquido seminale (IVF) o mediante iniezione intracitoplasmatica di un singolo spermatozoo (ICSI). Pre-impianto scissione embrioni allo stadio sono sottoposte a biopsia, di solito con la rimozione di una singola cellula il 3 ° giorno post-fertilizzazione, e la cellula biopsia è testato per stabilire lo status genetico dell&#39;embrione. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei fisso di cellule sottoposte a biopsia con target specifici per sonde di DNA è la tecnica di scelta per rilevare squilibrio cromosoma associata a riarrangiamenti cromosomici, e di selezionare gli embrioni femminili nelle famiglie con X-linked malattia per la quale non vi è nessuna mutazione specifica di test. PESCE è stato utilizzato anche per gli embrioni schermo per aneuploidie dei cromosomi spontanea (noto anche come PGS o PGD-AS) al fine di cercare di migliorare l&#39;efficienza di riproduzione assistita, tuttavia, il valore predittivo di questo test utilizzando la diffusione e la tecnica FISH descritta qui è probabile che sia inaccettabilmente basso nelle mani di molte persone e non è raccomandato per l&#39;uso clinico di routine. Descriviamo la selezione di apposite sonde per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla PGD in ambito clinico.

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FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

Trasferimento Genico per insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Ricerca

Medicina

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Ecografia transabdominale per la diagnosi di gravidanza nel cervo Muntjac di Reeves

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

La diagnosi di<em&gt; Muscolo gastrocnemio</em&gt; Tenuta - fattori chiave per l&#39;esame clinico

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, una piattaforma basata su Computer per aiutare i clinici nella diagnosi e analisi cardiovascolare

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Consenso internazionale degli esperti e raccomandazioni per la diagnosi ad ultrasuoni pneumotorace neoatale e la procedura di toracemite guidata dall'ultrasuoni

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnosi e trattamento chirurgico della spondilodiscite brucellare umana

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Test di acetilcolina seguita da adenosina per la diagnosi invasiva dei disturbi vasomotori coronarici

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Misurazione della produzione di lattato miocardico per la diagnosi di spasmo microvascolare coronarico

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and specific IgE (sIgE) determination in the evaluation of IgE-mediated allergic reactions to food, insect venom, drugs, as well as some forms of chronic urticaria. However, the role of this technique in the diagnostic algorithms is highly variable and not well determined.
BAT is based on the determination of basophil response to allergen/drug cross-linking IgE activation through the measurement of activation markers (such as CD63, CD203c) by flow cytometry. This test can be a useful and complementary tool to avoid controlled challenge tests&#160;to confirm allergy diagnosis, especially in subjects experiencing severe life-threatening reactions. In general, the performance of BAT should be considered if i) the allergen/drug produces false positive results in ST; ii) there is no allergen/drug source to use for ST or sIgE determination; iii) there is discordance between patient history and ST or sIgE determination; iv) symptoms suggest that ST may result in systemic response; v) before considering a CCT to confirm the culprit allergen/drug. The main limitations of the test are related to non-optimal sensitivity, especially in drug allergy, the need to perform the test no longer than 24 h after sample extraction, and the lack of standardization between laboratories in terms of procedures, concentrations, and cell markers.

The basophil activation test is a complementary in vitro diagnostic test for the evaluation of IgE-mediated allergic reactions based on the detection of basophil activation in the presence of a specific stimulus through the measure of activation markers by flow cytometry.

Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...