Name: fish for pre-implantation genetic diagnosis
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00
Duration: 7 min 34 s
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1. Lisis y Difusión de un núcleo de una biopsia de blastómeros <ol><li> Buffer de lisis celular de las células de la difusión (0,2% de Tween 20 en 0,01 M de HCl, pH 2,0) deben estar preparados 24 horas de antelación y se almacenan a -20 ° C. La preparación de 100 ml y filtrar 20 en un recipiente estéril de 30 ml universal, utilizando una aguja estéril jeringa de 20 ml y el filtro de la jeringa. Dispensar alícuotas de 1 ml en tubos de 1,7 ml 10-15 estéril de microcentrífuga, cierre y etiqueta de los tubos antes de la congelación. Es recomendable contar con dos lotes diferentes es el uso, el nuevo lote y el lote anterior, lo que ha sido probado y se puede utilizar si el nuevo grupo no es satisfactoria. </li><li> Descongele el tampón de lisis a temperatura ambiente 30 minutos antes de la biopsia. A efectos prácticos la temperatura de trabajo será entre la temperatura ambiente y temperatura de la mano. </li><li> Marca un círculo pequeño (aproximadamente 5 mm de diámetro) en la parte inferior de una diapositiva amina recubiertos (por ejemplo, Genetix) utilizando una pluma de diamantes y la etiqueta antes de la diapositiva con el número de caso, número de la diapositiva única, y la fecha de la biopsia. Utilice una diapositiva por separado para cada blastómero en orden numérico, y la etiqueta con el número de embriones. Las diapositivas deberán estar etiquetados con un lápiz duro como 4H, y &quot;borrado&quot; con un guante de látex para eliminar el polvo de grafito. </li><li> Coloque una pequeña cantidad de solución amortiguadora de lisis dentro del círculo. </li><li> La transferencia de la biopsia de blastómeros en el tampón de lisis. Si es necesario agregar solución amortiguadora de lisis dentro del círculo hasta que la célula comienza a lisar, lisis de la célula debe por completo y el citoplasma se dispersan antes de que se seque el buffer. </li><li> Observe el núcleo para asegurar que se mantiene dentro del círculo y no se pierde, y si el celular no tiene un núcleo o tiene múltiples núcleos, la biopsia otra celda. </li><li> Salga de la diapositiva se seque al aire a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Hibridación in situ en un núcleo único blastómeros <ol><li> Prepare una serie de etanol (70, 90 y 100%) prepararse en agua destilada estéril. </li><li> Activar y configurar el bloque de calor (por ejemplo, Hybaid Omnislide o Hybrite Vysis) a 75 ° C. </li><li> Descongele las sondas, vortex y centrifugar. Los reactivos deberán ser testigo y se comprueba su correcto antes de hacer la mezcla de sondas. Pipeta volúmenes según lo especificado por el fabricante para hacer la mezcla de la sonda en un tubo de microcentrífuga de 0,65 ml estéril y agitar y centrifugar antes de su uso. El volumen total de la mezcla de la sonda debe ser suficiente para permitir que l 2 por núcleo para ser probado y se redondea con una precisión de 10 l para permitir un margen de seguridad. </li><li> Pre-lavado de los portaobjetos en jarras Coplin con tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) por 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague los portaobjetos dos veces en agua destilada estéril. </li><li> Deshidratar las diapositivas con la serie de etanol (70, 90 y 100%) durante 2 minutos cada uno, a temperatura ambiente y el aire seco. Asegúrese de que las diapositivas se sumerge por completo y si el polvo de grafito flota a la superficie, cubra con un paño limpio. </li><li> Registrar la posición del núcleo dentro del círculo mediante la visualización con un microscopio de contraste de fase. </li><li> Deshidratan con etanol al 100% durante 2 min a temperatura ambiente y el aire seco. </li><li> Aplicar 2 l de la mezcla de la sonda, y cubrir con un cubreobjetos de 9 x 9 mm (un cuarto de 18 x 18 mm cubreobjetos n º 1). </li><li> Sellar los bordes del cubreobjetos con goma de cemento (por ejemplo, goma de vaca, de corrección de la vaca). </li><li> Codenature las diapositivas en un bloque caliente a 75 ° C durante 5 minutos, y después se hibridan las diapositivas durante la noche (16-20 h) en una cámara húmeda a 37 º C. Mezcla de la sonda que consisten enteramente de las sondas centrómero (es decir, ligada al sexo de los casos), dará un resultado satisfactorio después de 60 minutos de la hibridación. </li><li> Prepare un baño de agua con suficientes recipientes de Coplin y el calor a 71 ° C. </li><li> Preparar un 0,4 x citrato salino estándar (SSC) de solución de lavado estrictas (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mm C 6 H 5 O 7 Na 3 .2 H 2 O) y el calor en el baño de agua. </li><li> Vierta 50 mL de lavado estrictas por frasco Coplin necesario y comprobar que la temperatura es de 71 ° C inmediatamente antes de su uso mediante un termómetro limpio. </li><li> Retire con cuidado el cemento de caucho de cada diapositiva y enjuagar el cubreobjetos con 4x SSC/0.05% de Tween 20 (pH 7,0) a temperatura ambiente. </li><li> Se lavan los portas en el lavado de 0,4 x SSC estrictos a 71 ° C durante 5 min. Lavado de no más de 6 diapositivas por jarra de Coplin. </li><li> Se lavan los portas en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Si la mezcla contiene la sonda sonda indirectamente etiqueta (s), la fuga de las diapositivas de exceso de líquido y aplicar 20 L de anticuerpo conjugado con fluorescencia en un cuadrado de 20 x 20 mm de Parafilm. </li><li> Incubar en una cámara húmeda a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Retire el Parafilm y lavar de vez en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Lavar dos veces durante 2 minutos en PBS unat la temperatura ambiente y de drenaje de las diapositivas. </li><li> Aplique 6 l de DAPI / Vectashield (160 ng de 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihidrocloruro de 1 mL de medio de montaje Vectashield, Vector Laboratories) a un 22 x 22 mm no. 0 cubreobjetos y se invierte el portaobjetos sobre el cubreobjetos. </li><li> Blot y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. </li></ol> 3. Análisis utilizando un microscopio de fluorescencia debidamente equipados con los filtros adecuados para las sondas utilizadas. <ol><li> Señales de puntuación mediante la visualización directa utilizando un microscopio de fluorescencia y un solo filtros pasa banda para cada fluorocromo en el ensayo. Cada núcleo debe ser anotado por dos analistas. Como regla general, debe conducir a la puntuación de una sola señal en dos señales muy próximas entre sí menos de un dominio (la señal de ancho) de distancia, sin embargo, el juicio basado en la experiencia debe ser ejercido para interpretar las señales de diferente tamaño, intensidad, y la separación. </li><li> El uso del software de imágenes (por ejemplo, Isis, MetaSystems, Altlußheim, Alemania; CytoVision, Genetix) para capturar una imagen del núcleo de la confirmación del diagnóstico visual y archivo de imágenes como parte de un plan de garantía de calidad de laboratorio. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Metafase y núcleos en interfase de cultivo de linfocitos de sangre periférica debe ser examinado para confirmar que las sondas seleccionadas son específicas para los cromosomas de translocación, informativo de los puntos de ruptura (las sondas de hibridación subtelomere debe sólo a los segmentos de translocación y la sonda centrómero (s) a la céntrica segmento (s)) y las señales de los núcleos en interfase debe ser brillante y discreto. Anotar el número de señales para cada sonda en 100 núcleos en interfase de cada socio, se recomienda evaluar la eficiencia de la prueba. En este caso, dos señales se anotó en el 95% -99% de los núcleos de cada sonda. La figura 1 muestra una metafase y el núcleo de la interfase de una preparación para una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9. Las señales en los núcleos en interfase de blastómeras de embriones debe ser brillante y discreto y anotó con distintos filtros de paso de banda de los colores utilizados. La figura 2 muestra un núcleo blastómero con un patrón de señal normal (2 copias de todos los loci a prueba), en consonancia con un complemento cromosómico normal o equilibrado para el cromosoma 5 y 9, y un núcleo con un patrón de señal anormal en consonancia con un producto de la translocación desequilibrada que ha monosomía (una copia) para el segmento translocado del cromosoma 5 y la trisomía (tres copias) para el segmento translocado del cromosoma 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Una extensión metafase y una interfase núcleo preparado a partir de cultivos de linfocitos de sangre periférica de un portador de una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9, con puntos de interrupción en 5p14.3 y 9p24.1:. 46, XY, t (5 , 9) (p14.3;. p24.1) ISH t (5; 9) (5ptel48, 9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 +, 9cen +). Sondas de FISH fueron seleccionados para ambos segmentos translocados (5p14.3 → 5pter, rojo Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) y el segmento centrado en el cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, azul Abbott CEP 9 alfa satélite SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Señales de la figura 2. Núcleos en interfase blastómero de tres días-embriones capturado utilizando un filtro diferente para cada fluorocromo y se fusionaron para formar una imagen compuesta. (A) dos señales para cada sonda que indica dos copias de cada lugar, lo cual es consistente con un complemento normal o equilibrado de los cromosomas de translocación. (B) Una luz roja, tres señales de color verde y dos señales de color azul indicando una copia del segmento translocado del cromosoma 5, tres copias del segmento translocado del cromosoma 9 y dos copias del segmento centrado del cromosoma 9, lo cual es consistente con la adyacente -1 segregación de la translocación que resulta en un producto desequilibrado con monosomía para 5p14.3 → 5pter y la trisomía para 9p24.1 → 9pter.

<ol>
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R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyomapping,+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes.">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li></ol>

La aplicación de la hibridación in situ fluorescente (FISH) en una celda de un solo embrión (blastómero) presenta desafíos especiales tanto en los aspectos prácticos y en la interpretación del patrón de la señal. La célula de la biopsia debe ser extendido en un área predefinida en la diapositiva con el fin de facilitar su localización PESCADO siguientes; extremo cuidado se debe tener para garantizar que la célula se lisa, que el citoplasma se ha dispersado, y que el núcleo es visible e intacto, y, como el diagnóstico depende de los resultados de esta célula, puntuación e interpretación estricta directrices se deberían aplicar. Sin embargo, en manos experimentadas, el pescado es una técnica robusta para el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en la práctica clínica. El principio de la DGP por FISH es que se dirigen a sondas de ADN específicas marcadas con fluorocromos diferentes haptenos puede ser utilizado para detectar el número de copias de loci específicos, y por lo tanto para detectar desequilibrio cromosómicas asociadas con la segregación meiótica de redistribución de cromosomas (1), incluyendo robertsoniana translocaciones, translocaciones recíprocas, inversiones y reorganizaciones complejas (2). Los peces también pueden ser utilizados para seleccionar los embriones femeninos en las familias con la enfermedad ligada al cromosoma X, por lo que no hay ninguna prueba de la mutación específica (3, 4). Más polémico, el pescado ha sido utilizada para detectar aneuploidías cromosómicas esporádicas con el fin de tratar de mejorar la eficiencia de la reproducción asistida (5, 6), sin embargo, el valor predictivo de esta prueba con FSIH es probable que sea inaceptablemente bajo en la mayoría de la gente las manos y no se recomienda el uso clínico de rutina (7). Este artículo se centra en los aspectos técnicos y las limitaciones de FISH clínica aplicada a una sola célula diagnóstico. Los métodos de difusión y fijación de blastómeros independientes, incluyen metanol / ácido acético (5, 8), Tween / HCl (9), y una combinación de Tween / HCl y metanol / ácido acético (10). Las variaciones incluyen el tratamiento hipotónico de las células antes de la difusión y / o la pepsina y el tratamiento de paraformaldehído después de la fijación. El método debe ser validado adecuadamente para el laboratorio (14). El método de interpolación / HCl se describe en detalle en este artículo. El método de interpolación / HCl es técnicamente sencilla y altamente reproducibles en diferentes laboratorios. Este método puede ser utilizado para preparar los núcleos individuales para el diagnóstico FISH de la determinación del sexo y la redistribución de cromosomas con una precisión aceptable de diagnóstico (7). Mezcla de la sonda puede combinar directamente etiquetados y marcados indirectamente sondas y las sondas de diferentes fabricantes. Sondas para conocer las regiones cromosómicas polimórficos (11, 12), o que se sabe que hibridizan de forma significativa con otros cromosomas (13) se debe evitar, aunque se puede utilizar si se demuestra que ser específico y adecuado para PGD por las pruebas a las dos partes antes de la reproducción . Fluorocromos disponible / haptenos y estrategias para las sondas de la discriminación son los siguientes: Texas Red (TR), isotiocianato de fluoresceína (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondas con biotina detectados con TR-avidina, FITC avidina-, o Cy-5 estreptavidina (visualizado usando un filtro FarRed), una mezcla de sondas rojas y verdes para producir una señal amarilla, una segunda ronda de hibridación y un tercer color creado por la captura secuencial de SpectrumOrange con un TexasRed y un filtro de SpectrumGold). Una sonda conjunto con tres sondas, específicas para las regiones del centrómero de los cromosomas X e Y y un autosoma, se recomienda para la determinación del sexo (14), la sonda autosómico se utiliza para establecer la ploidía y modo de diferenciar entre X trisomía (2n, de 47 años , XXX) y la triploidía (3n, 69, XXX), y entre tetrasomía X (48, XXXX) y tetraploides (4n, 92, XXXX). Una sonda típica situada a aplicar en este contexto es la mezcla AneuVysion Abbott que contengan alfa-satélite X, Y, y 18, este conjunto de la sonda se ha demostrado que tienen una tasa de polimorfismo muy bajo, y por lo tanto el tratamiento previo con el trabajo de los socios de reproducción no es necesario (14). La mezcla de sondas para cualquier reordenamiento específico debe: Lo ideal sería que contienen sondas al menos suficiente para detectar todos los productos que se espera de la reorganización con desequilibrio cromosómico. Si esto no es posible, la sonda se mezcla en los productos desequilibrada detectados han sido evaluados como no viables en un embarazo reconocible y es probable que tengan una prevalencia muy baja puede ser aceptable (14). Ser probado en cultivos de linfocitos metafases de ambas partes reproductivas. Por lo menos diez se extiende metafase deben ser examinados por la especificidad de la sonda, los polimorfismos y la hibridación cruzada, y, para el transportista reordenamiento cromosómico, para asegurarse de que las sondas de hibridación como se esperaba a los diferentes segmentos de la reordenación. Además, al menos 100 núcleos en interfase de estos preparados debe ser anotado para evaluar la especificidad de la señal, el brillo y discreto (14). Commercial sonda fija PGS están disponibles (por ejemplo, Abbott MultiVysion PB o PGT), dirigido a los cromosomas más frecuentemente encontrado para ser aneuploides en los productos de la concepción, y que comprende una sola sonda por cromosoma objetivo. Normalmente, el núcleo puede tener una segunda hibridación con sondas para los cromosomas adicionales que proporcionan un análisis de los cromosomas 13, 15, 16, 18, 21, 22, y XY (14). El valor predictivo de esta prueba con la difusión y la técnica de FISH se describe aquí es probable que sea inaceptablemente bajo en las manos de la mayoría de la gente y no se recomienda para el uso clínico de rutina (7, 15). Técnicas tales como la hibridación genómica comparativa (CGH) aplicada a células individuales son capaces de probar el número de copias de cada cromosoma (Wilton et al. 2001), y el uso de polimorfismos de nucleótido único (SNP) y las matrices de análisis cuantitativo (Wells et al . 2008) o &quot;karyomapping&quot; de genotipado (Handyside et al. 2009) son prometedoras técnicas alternativas para detectar aneuploidías cromosómicas. Sin embargo, el límite de la resolución y la precisión de desequilibrio segmento sigue siendo incierto y es probable que el pescado siguen siendo la técnica de elección para la participación de los reordenamientos cromosómicos en pequeños segmentos.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hydrochloric Acid, 2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>101254H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride, 5Kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>443827W</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride, 250g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>26764.232</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>102494C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>10203 4B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide Pellets, 500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28245.265</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween20, 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>663684B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, 2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>8.18760.2500</td>
<td>Duty Paid</td>
</tr>
<tr>
<td>Tri-Sodium Citrate, 5Kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>27833.363</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cow Gum, 250mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cow Proofings Ltd.</td>
<td>No longer available</td>
<td>Old stocks can still be found in art shops</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI/Antifade ES, 0.125&mu;g/mL, 500ul</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytocell</td>
<td>DES500L</td>
<td>150&mu;l vial rec&#x2019;d with each Cytocell TEL Probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Nail Varnish, 12mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boots</td>
<td>10088316001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amine-coated Slides, 25</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>K2615</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI, 0.1mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield, 10mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas-Red-avidin, 0.001mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>A-2016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITC-avidin, 0.001mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>A-2011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Streptavidin, 0.001mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>PA45001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thistle Scientific</td>
<td>AX-MCT-175-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thistle Scientific</td>
<td>AX-MCT-060-C-CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30ml Universal Containers, box of 400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sterilin</td>
<td>128B</td>
<td>Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR VWR VWR</td>
<td>451-0107 451-3112 451-3111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plugged Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PMK-300-052R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wild Heerbrugg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissues, 100boxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NHS SUPPLY CHAIN</td>
<td>MJT058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metal Culture Trays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Melamine Trays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>682-009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth Pipette Mouthpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>HAE3700 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Filter, 0.2&mu;m pore size, 25mm diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>FDM-340-010U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diamond Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>818-0021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Block for Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Hybaid</td>
<td>HBOSBB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Roll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NHS SUPPLY CHAIN</td>
<td>MJT004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schieferdecker Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-9313</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-9331</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps, Fine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>232-2123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps, Blunt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>232-2113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1000mL Beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>213-1642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Contrast Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>E200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibre-free Blotting Cards, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (Raymond Lamb)</td>
<td>SDE1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>MIC3206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1mL Syringe, box of 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NHS Supply Chain</td>
<td>FWC045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1mL Pipette Tip, 10racks of 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thistle Scientific</td>
<td>AX-T-1000-C-L-R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LEEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Waterbath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grant</td>
<td>W22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcohol Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various sources available</td>
</tr>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jenway</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Electrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>662-1759</td>
<td>BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305</td>
</tr>
<tr>
<td>Heated Stirrer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bibby</td>
<td>HC502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1mL Pasteur Pipettes, box of 500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
<td>PIP4202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm, 50mm x 75m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>291-1214</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fish for pre-implantation genetic diagnosis

El diagnóstico de preimplantación genética (PGD) es una alternativa establecida para el diagnóstico prenatal, y consiste en la selección de embriones previo a la implantación de una cohorte generados por la tecnología de reproducción asistida (ART). Esta selección puede ser requerido por familiares enfermedad monogénica (fibrosis quística, por ejemplo), o por una pareja lleva un reordenamiento cromosómico (por ejemplo, una traslocación recíproca de dos vías). El DGP está disponible para las parejas que han tenido anteriormente los niños afectados, y / o en el caso de reordenamientos cromosómicos, abortos involuntarios recurrentes o infertilidad. Los ovocitos aspirados estimulación ovárica siguientes son fecundados por inmersión en vitro en el semen (FIV) o inyección intracitoplasmática de espermatozoide un individuo (ICSI). Pre-implantación el estadio de división de embriones se realiza una biopsia, por lo general por la eliminación de una sola célula en el día 3 después de la fertilización, y la célula de la biopsia se analiza para establecer el estado genético del embrión. Hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de las células de la biopsia fija con el objetivo específico de sondas de ADN es la técnica de elección para detectar desequilibrios cromosómicos asociados con reordenamientos cromosómicos, y para seleccionar los embriones femeninos en las familias con la enfermedad ligada al cromosoma X para el que no se no hay mutación específica de la prueba. De pescado también ha sido utilizado para seleccionar embriones de aneuploidías cromosómicas espontáneas (también conocido como SPG o PGD AS-) con el fin de tratar de mejorar la eficiencia de la reproducción asistida, sin embargo, el valor predictivo de esta prueba con la difusión y la técnica de FISH se describe aquí es probable que sea inaceptablemente bajo en las manos de la mayoría de la gente y no se recomienda para el uso clínico de rutina. Se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicado al DGP en un entorno clínico.

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FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

Transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Investigación

Medicina

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Ultrasonido transabdominal para el diagnóstico del embarazo en los ciervos muntjac de Reeves

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

El diagnóstico de la<em&gt; Musculus Gastronemio</em&gt; Opresión - Factores clave para el Examen Clínico

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, una plataforma basada en la computadora para ayudar a los clínicos en el diagnóstico y análisis Cardiovascular

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Consenso Internacional de Expertos y Recomendaciones para el Diagnóstico por Ultrasonido Neumotórax Neonatal y Procedimiento de Toracentesis guiada por Ultrasonido

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnóstico y Tratamiento Quirúrgico de la Espondylodiscitis Humana Brucellar

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Prueba de acetilcolina seguida de adenosina para el diagnóstico invasivo de trastornos vasomotores coronarios

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Medición de la producción de lactato miocárdico para el diagnóstico del espasmo microvascular coronario

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and specific IgE (sIgE) determination in the evaluation of IgE-mediated allergic reactions to food, insect venom, drugs, as well as some forms of chronic urticaria. However, the role of this technique in the diagnostic algorithms is highly variable and not well determined.
BAT is based on the determination of basophil response to allergen/drug cross-linking IgE activation through the measurement of activation markers (such as CD63, CD203c) by flow cytometry. This test can be a useful and complementary tool to avoid controlled challenge tests&#160;to confirm allergy diagnosis, especially in subjects experiencing severe life-threatening reactions. In general, the performance of BAT should be considered if i) the allergen/drug produces false positive results in ST; ii) there is no allergen/drug source to use for ST or sIgE determination; iii) there is discordance between patient history and ST or sIgE determination; iv) symptoms suggest that ST may result in systemic response; v) before considering a CCT to confirm the culprit allergen/drug. The main limitations of the test are related to non-optimal sensitivity, especially in drug allergy, the need to perform the test no longer than 24 h after sample extraction, and the lack of standardization between laboratories in terms of procedures, concentrations, and cell markers.

The basophil activation test is a complementary in vitro diagnostic test for the evaluation of IgE-mediated allergic reactions based on the detection of basophil activation in the presence of a specific stimulus through the measure of activation markers by flow cytometry.

Prueba de activación de basófilos para el diagnóstico de alergia

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...