Name: neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations at JoVE.com

We willen graag Donald Hutson bedanken voor hun bijdrage zijn technische expertise en grote vaardigheid bij het ontwerp en de fabricage van de fase-top incubator. We zijn ook dankbaar dat Ayda Dashtaei voor haar uitstekende technische bijstand. Al het werk werd ondersteund door Neurowetenschappen Research Foundation.

<ol>
	<li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons.">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li><li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria.">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li><li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in neuroscience. , (1999).</li><li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for neural cell culture. , (2001).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons.">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li></ol>

Gebruikmakend van lentivirus-gemedieerde expressie van een fluorescerend eiwit gericht op mitochondria in geïnfecteerde gekweekte neuronen en een goedkope lab-bouwfase-top incubator die beeldvorming van levende cellen voor langere duur maakt, zijn we in staat geweest om de link tussen beweging en mitochondriale neuromodulatory signalen te onderzoeken , zoals serotonine (5-HT), dopamine (DA) en acetylcholine (ACh). Onze studies hebben bijgedragen tot een signaalroute dat voor de eerste keer, mitochondriale mensenhandel links naar veranderingen in de activiteit van neuronen-gemoduleerd door neurotransmitters zoals 5-HT en DA verduidelijken - die zich in het hart van de neurale functie. We vinden dat het gebruik van gerichte fluorescente eiwitten de observatie van gelabelde mitochondria in levende gekweekte neuronen gedurende langere perioden die mogelijk meer fysiologisch relevante dan de veel kortere duur, die mogelijk met behulp van vitale kleurstoffen vergunningen. Bovendien is de intensiteit van het fluorescerende eiwit signaal stelt ons in staat om de blootstelling keer kort te houden tijdens het beeld acquisitie, het minimaliseren van de mogelijkheid van fotobleken of fototoxiciteit. Ten slotte is een eenvoudige en goedkope stage-top incubator die omgevingstemperatuur, vochtigheid en CO 2 niveau handhaaft, terwijl het minimaliseren van de verdamping van de media, laat ons toe om mitochondriale beweging volgen in levende neuronen in uren of zelfs dagen. Onderzoekers die wensen om een ​​stage-top incubator fabriceren voor de lange-termijn observaties van mitochondriën in levende neuronen hoeft niet aan de precieze details van ons ontwerp, op voorwaarde dat de eigenschappen van de gebruikte materialen (bijvoorbeeld gas permeabel membraan om verdamping van de media te voorkomen ) en principes toegepast (bijvoorbeeld, temperatuur en luchtvochtigheid, buffering van de pH, onderhoud van de osmolariteit) zijn over het algemeen consistent met wat is beschreven in dit protocol.

<table border="1"><tbody><tr><th> Hoeveelheid </th><th> Beschrijving (en locatie in Figuur 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Weefselkweek incubator (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hittebestendige kunststof behuizing (Delrin of vergelijkbaar) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kunststof frame voor 35mm GBM deksel (voor het aanbrengen van membraan naar petrischaal) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> lineaire ft Clear PFTE (Teflon) membraanmateriaal </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Messing duimschroeven </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Kleine 10kOhm heatsink weerstanden (gebruikt als verwarmings-elementen binnen stage-top incubator behuizing) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformator (levering van stroom naar 9V weerstanden) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrarium temperatuurregelaar en sonde (thermostatische regeling van kracht om heatsink weerstanden via transformator) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml erlenmeyer (demper voor trillingen in de slang voor de stage-top incubator) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;sorbothane vel (pakking materiaal voor de basis van stage-top incubator) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Luchtdicht ABS (of vergelijkbare) plastic doos (behuizing voor aquarium pomp) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Aquarium pomp (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kleine computer koelventilator </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Plastic behuizing voor ventilator (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V transformator voor computer koelventilator </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Nalgene of siliconen slang (verbindingen tussen weefselkweek en podium-top incubatoren; vocht vallen) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Plastic kranen (voor het openen en te sluiten voordat de luchtstroom en na de stage-top incubator) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Prikkeldraad messing slang-aansluitingen (voor de slang verbindingen van / naar stage-top incubator en aquarium pomp behuizing) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Messing snelkoppelingen (voor de slang verbindingen naar / van stage-top incubator) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Messing snelkoppelingen (voor de slang verbindingen naar / van stage-top incubator) </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Stage-top incubator delen: <table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminine </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm met glazen bodem gerechten </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Lipide-rijke BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-Proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> Vitamine B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100mg </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100mg </td></tr></tbody></table>

neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations

Om te begrijpen van de relatie tussen mitochondriale vervoer en de neuronale functie, is het essentieel om mitochondriale gedrag in levende gekweekte zenuwcellen voor een langere duur van 1-3 te nemen. Dit is nu mogelijk door het gebruik van vitale kleurstoffen en fluorescerende eiwitten waarmee cytoskelet componenten, organellen, en andere structuren in levende cellen kunnen worden gelabeld en vervolgens gevisualiseerd via dynamische fluorescentie microscopie. Bijvoorbeeld, in embryonale kip sympathische neuronen, was mitochondriale beweging gekarakteriseerd met behulp van de vitale kleurstof rhodamine 123 4. In een andere studie, mitochondriën werden gevisualiseerd in de rat voorhersenen neuronen door transfectie van mitochondrially gerichte EYFP 5. Echter, beeldvorming van de primaire neuronen gedurende minuten, uren of zelfs dagen presenteert een aantal punten. De belangrijkste hiervan zijn: 1) het onderhoud van de kweekomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid en pH tijdens lange sessies beeldvorming, 2) een sterke, stabiele fluorescerende signaal naar zowel de kwaliteit van verworven beelden en nauwkeurige meting van de intensiteit van het signaal tijdens de beeldanalyse te verzekeren; en 3) het beperken van de blootstelling keer tijdens beeldacquisitie aan fotobleken te minimaliseren en te vermijden fototoxiciteit. We beschrijven hier een protocol dat de waarneming, visualisatie en analyse van mitochondriale beweging in gekweekte hippocampale neuronen met een hoge temporele resolutie en onder optimale condities leven toelaat. We hebben geconstrueerd een betaalbare stap-top incubator dat een goede temperatuurregeling en atmosferische gasstroom verleent, en beperkt ook de mate van media verdamping, verzekeren een stabiele pH en osmolariteit. Deze incubator is aangesloten, via de inlaat en uitlaat slangen, met een standaard weefselkweek incubator, die een constante vochtigheidsgraad en een sfeer van 5-10% CO 2 / lucht levert. Dit ontwerp biedt een kosteneffectief alternatief voor de veel duurdere microscoop incubators die niet noodzakelijk de levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren gedurende vele uren of zelfs dagen. Om dit te visualiseren mitochondriën, we cellen infecteren met een lentivirus dat codeert voor een rood fluorescerend eiwit dat is gericht op het mitochondrion. Dit zorgt voor een sterke en aanhoudende signalen, die in samenhang met het gebruik van een stabiele xenon lichtbron, laat ons toe om belichtingstijden beperken tijdens beeldacquisitie en alles, maar sluit fotobleken en fototoxiciteit. Twee injectie-poorten aan de bovenkant van het podium-top incubator kan de acute toediening van neurotransmitters en andere reagentia bedoeld om moduleren mitochondriale beweging. Kortom, lentivirus-gemedieerde expressie van een organel-gerichte rood fluorescerend eiwit en de combinatie van onze stage-top incubator, een conventionele omgekeerde fluorescentie microscoop, CCD-camera, en xenon lichtbron ons toelaten om time-lapse beelden van de mitochondriale vervoer te verwerven in levende neuronen over een langere duur dan die mogelijk is in studies inzetten van conventionele vitale kleurstoffen en off-the-shelf life support systemen.

Watch this Scientific Journal Video about Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations at JoVE.com

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Beschrijven we een protocol dat beeldvorming van mitochondriën kan in levende neuronen via fluorescentie microscopie over lange duur. Imaging gedurende langere perioden wordt bereikt door lentivirus-gemedieerde expressie van een mitochondrially gerichte fluorescerend eiwit en het gebruik van een goedkope stage-top incubator, dat is ontworpen en gebouwd in ons laboratorium.

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...