Name: neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations at JoVE.com

Nous tenons à remercier Donald Hutson pour contribuer son expertise technique et une grande habileté lors de la conception et la fabrication de l&#39;incubateur en scène haut. Nous sommes également reconnaissants à Ayda Dashtaei pour son excellente assistance technique. Tout le travail a été soutenu par Neurosciences Research Foundation.

<ol>
	<li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons.">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li><li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria.">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li><li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in neuroscience. , (1999).</li><li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for neural cell culture. , (2001).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons.">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li></ol>

Employant lentivirus médiée par l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente ciblé à la mitochondrie dans les neurones infectés cultivé et un peu coûteux en laboratoire construit étape-top incubateur qui permet l&#39;imagerie de cellules vivantes pour des durées prolongées, nous avons été en mesure d&#39;étudier le lien entre le mouvement des mitochondries et des signaux neuromodulateurs , tels que la sérotonine (5-HT), la dopamine (DA), et l&#39;acétylcholine (ACh). Nos études ont permis d&#39;élucider une voie de signalisation qui, pour la première fois, le trafic mitochondrial liens à des changements dans l&#39;activité des neurones modulée par des neurotransmetteurs tels que la 5-HT et DA - qui sont au cœur de la fonction neuronale. Nous constatons que l&#39;utilisation de protéines fluorescentes ciblées permet l&#39;observation des mitochondries étiquetés dans la vie des neurones cultivés sur de longues périodes qui peuvent être plus physiologiquement pertinents que les durées beaucoup plus courtes qui sont possibles en utilisant des colorants vitaux. Par ailleurs, l&#39;intensité du signal fluorescent protein nous permet de garder le temps d&#39;exposition courts lors de l&#39;acquisition, en minimisant la possibilité de photoblanchiment ou de phototoxicité. Enfin, une étape-top simple et peu coûteux incubateur qui maintient la température ambiante, l&#39;humidité et de CO 2 niveaux, tout en minimisant l&#39;évaporation de médias, nous permet de suivre le mouvement des mitochondries dans la vie des neurones pendant des heures voire des jours. Les chercheurs qui souhaitent fabriquer un incubateur étape-top pour les observations à long terme des mitochondries dans des neurones vivants ne doivent pas suivre les détails précis de notre conception, à condition que les propriétés des matériaux utilisés (par exemple, le gaz membrane perméable pour éviter l&#39;évaporation des médias ) et les principes appliqués (par exemple, contrôle de la température et l&#39;humidité, du pH tampon, le maintien de l&#39;osmolarité) sont généralement compatibles avec ce qui est décrit dans ce protocole.

<table border="1"><tbody><tr><th> Quantité </th><th> Description (et l&#39;emplacement dans la Figure 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Incubateur de culture tissulaire (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Résistant à la chaleur boîtier en plastique (delrin ou comparables) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Cadre en plastique pour le 35mm GBM couvercle (pour l&#39;apposition membrane pour boîte de Petri) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> linéaires pi matériels Effacer PTFE membrane (téflon) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Vis à oreilles en laiton </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Petites résistances radiateur 10kOhm (utilisés comme éléments de chauffage à l&#39;intérieur en scène haut de l&#39;enceinte incubateur) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformateur (fourniture de courant 9V à résistances) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Régulateur de température et sonde terrarium (régulation thermostatique de la puissance aux résistances du radiateur via transformateur) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyer (silencieux pour la suppression des vibrations dans les tuyaux avant l&#39;étape-dessus incubateur) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 feuilles sorbothane &quot;(matériau de joint pour la base de l&#39;étape-dessus incubateur) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hermétique ABS (ou comparable) boîte en plastique (boîtier de la pompe d&#39;aquarium) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Pompe d&#39;aquarium (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Petit ventilateur d&#39;ordinateur </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Boîtier en plastique pour ventilateur de refroidissement (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V transformateur pour ventilateur d&#39;ordinateur </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Tuyau Nalgene ou de silicone (liens entre la culture de tissus et le stade-top incubateurs; pièges à humidité) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Robinets en plastique (pour ouvrir et fermer le débit d&#39;air avant et après l&#39;étape-dessus incubateur) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Raccords de tuyaux en laiton barbelé (pour les raccords de tuyau de / vers l&#39;étape-top incubateur et enceinte de la pompe d&#39;aquarium) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Coupleurs rapides en laiton (pour les raccords de tuyau de / vers l&#39;étape-top incubateur) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Coupleurs rapides en laiton (pour les raccords de tuyau de / vers l&#39;étape-top incubateur) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Stage-dessus des pièces incubateur: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminine </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm à fond de verre plats </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Riche en lipides BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-asparagine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> La vitamine B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25MG </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25MG </td></tr><tr><td> Dopamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25MG </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations

Pour comprendre la relation entre le transport mitochondrial et la fonction neuronale, il est essentiel d&#39;observer le comportement des mitochondries en direct neurones cultivés pour des durées étendu 1-3. C&#39;est maintenant possible grâce à l&#39;utilisation de colorants vitaux et des protéines fluorescentes avec laquelle les composants du cytosquelette, les organites, et d&#39;autres structures dans les cellules vivantes peuvent être étiquetées et ensuite visualisé par microscopie à fluorescence dynamique. Par exemple, dans les neurones embryonnaires de poulet sympathique, le mouvement mitochondrial a été caractérisée en utilisant la rhodamine colorant vital 123 4. Dans une autre étude, les mitochondries ont été visualisées dans les neurones du cerveau antérieur chez le rat par transfection de mitochondrially ciblées EYFP 5. Cependant, l&#39;imagerie des neurones primaires en quelques minutes, heures, jours ou même présente un certain nombre de questions. Ce sont notamment les suivants: 1) le maintien de conditions de culture telles que la température, l&#39;humidité et du pH au cours des séances d&#39;imagerie longue; 2) un signal fort et stable, fluorescentes pour assurer la qualité des images acquises et la mesure précise de l&#39;intensité du signal pendant l&#39;analyse d&#39;image; et 3) la limitation des temps d&#39;exposition lors de l&#39;acquisition d&#39;images pour minimiser photoblanchiment et d&#39;éviter la phototoxicité. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l&#39;observation, la visualisation et l&#39;analyse du mouvement des mitochondries dans des cultures de neurones de l&#39;hippocampe avec une résolution temporelle élevée et dans des conditions optimales de survie. Nous avons construit un prix abordable étape-top incubateur qui permet une régulation de température et de débit de gaz bonne atmosphère, et limite également le degré d&#39;évaporation des médias, en assurant un pH stable et l&#39;osmolarité. Cet incubateur est connecté, via l&#39;entrée et la sortie de tuyaux, d&#39;une norme incubateur de culture tissulaire, qui fournit des niveaux d&#39;humidité constante et une atmosphère de 5-10% de CO 2 / air. Cette conception offre une alternative rentable aux incubateurs microscope sensiblement plus cher que ne garantit pas nécessairement la viabilité des cellules pendant plusieurs heures voire plusieurs jours. Pour visualiser la mitochondrie, nous infecter les cellules avec un lentivirus codant pour une protéine fluorescente rouge qui est ciblé vers la mitochondrie. Ceci assure un signal fort et persistant, qui, en conjonction avec l&#39;utilisation d&#39;une source de lumière au xénon stable, nous permet de limiter les temps d&#39;exposition lors de l&#39;acquisition d&#39;images et de tous, mais exclut photoblanchiment et de phototoxicité. Deux ports d&#39;injection sur le dessus de l&#39;incubateur en scène haut permettent l&#39;administration aiguë de neurotransmetteurs et autres réactifs destinés à moduler le mouvement des mitochondries. En somme, lentivirus médiée par l&#39;expression d&#39;un organite ciblées protéine fluorescente rouge et la combinaison de notre stade-dessus incubateur, une conventionnelles microscope inversé à fluorescence, caméra CCD, et la source lumineuse au xénon nous permettent d&#39;acquérir des images en accéléré du transport mitochondrial neurones vivants sur de longues durées que celles possibles dans les études conventionnelles de déployer des colorants vitaux et off-the-shelf systèmes de survie.

Watch this Scientific Journal Video about Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations at JoVE.com

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nous décrivons un protocole qui permet l&#39;imagerie de la mitochondrie dans la vie des neurones par l&#39;intermédiaire de microscopie par fluorescence sur des durées longues. Imagerie sur de longues périodes est accompli par des lentivirus médiée par l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente mitochondrially ciblées et l&#39;utilisation d&#39;un moyen peu coûteux étape-top incubateur qui a été conçu et construit dans notre laboratoire.

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Recherche

Neurosciences

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Détermination des espèces d&#39;oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...