Name: neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00
Duration: 4 min 50 s
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Wir möchten Donald Hutson für den Beitrag seines technischen Know-how und viel Geschick bei der Konstruktion und Herstellung von der Bühne-Top-Inkubator danken. Wir sind auch dankbar, dass Ayda Dashtaei für ihre hervorragende technische Unterstützung. Alle Arbeiten wurden von Neurosciences Research Foundation unterstützt.

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	<li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons.">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li><li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria.">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li><li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in neuroscience. , (1999).</li><li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for neural cell culture. , (2001).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons.">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li></ol>

Der Einsatz Lentivirus-vermittelte Expression eines fluoreszierenden Proteins gezielt an die Mitochondrien in infizierten kultivierten Neuronen und eine preiswerte Labor Baustufe-Top-Inkubator, der Bildgebung an lebenden Zellen für längere Laufzeiten ermöglicht, haben wir in der Lage, die Verbindung zwischen mitochondrialen Bewegung und neuromodulatorischen Signale zu untersuchen wie Serotonin (5-HT), Dopamin (DA) und Acetylcholin (ACh). Unsere Studien haben dazu beigetragen, einen Signalweg, der zum ersten Mal, Links mitochondrialen Menschenhandel zu Veränderungen in der Aktivität von Neuronen moduliert durch Neurotransmitter wie 5-HT-und DA-Aufklärung -, dass im Herzen der neuronalen Funktion. Wir finden, dass die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen gezielt die Beobachtung der markierten Mitochondrien in lebenden kultivierten Neuronen über lange Zeiträume, die mehr physiologisch relevanter als die viel kürzere Laufzeiten möglich sind, mit vitalen Farbstoffe können zulässt. Darüber hinaus ermöglicht die Intensität der fluoreszierenden Proteins Signal uns zu halten Belichtungszeiten kurz während der Bildaufnahme, minimiert die Möglichkeit von Ausbleichen oder Phototoxizität. Schließlich ermöglicht eine einfache und kostengünstige Stufe-Top-Inkubator, der Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2-Gehalt führt, bei gleichzeitiger Minimierung der Verdunstung von Medien, uns zu mitochondrialen Bewegung in lebenden Nervenzellen über Stunden oder sogar Tage zu folgen. Forscher, die auf einer Bühne-Top-Inkubator für die Langzeit-Beobachtungen von Mitochondrien Herstellung in lebenden Neuronen wollen, müssen sich nicht an die genauen Einzelheiten unserer Design, vorausgesetzt, die Eigenschaften der verwendeten Materialien (z. B. Gas-durchlässige Membran zur Verdampfung von Medien zu vermeiden ) und Grundsätze angewandt (zB Temperatur und Luftfeuchtigkeit, Pufferung des pH-Wertes, die Aufrechterhaltung der Osmolarität) sind in der Regel im Einklang mit dem, was in diesem Protokoll beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><th> Menge </th><th> Beschreibung (und Lokalisierung in Abbildung 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Gewebekultur-Inkubator (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hitzebeständigem Kunststoff-Gehäuse (Delrin oder vergleichbare) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kunststoff-Rahmen für 35mm GBM Deckel (für die Anbringung Membran Petrischale) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> linear ft. Klare PFTE (Teflon) Membran-Material </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Messing Flügelschrauben </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Kleine 10kOhm Kühlkörper Widerstände (verwendet als Heizelemente im Inneren der Bühne-Top-Inkubator-Gehäuse) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformer (Versorgung mit 9V Strom Widerstände) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrarium Temperaturregler und Sonde (thermostatische Regulierung der Macht an Kühlkörper Widerstände über Trafo) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyerkolben (Schalldämpfer für Schwingungsdämpfung im Schlauch vor der Stufe-Top-Inkubator) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;Sorbothane Blatt (Dichtungsmaterial für die Basis der Stufe-Top-Inkubator) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Luftdichte ABS (oder vergleichbar) Kunststoff-Box (Gehäuse für Aquarium-Pumpe) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Aquarium Pumpe (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kleine Computer-Lüfter </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kunststoffgehäuse für Lüfter (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V Transformator für Computer-Lüfter </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Nalgene oder Silikonschlauch (Verbindungen zwischen Gewebekultur und Bühne-Top-Inkubatoren, Feuchtigkeit Fallen) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Plastic Hähne (zum Öffnen und Schließen Luftstrom vor und nach der Phase-Top-Inkubator) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Barbed Messing Schlauchverbinder (für Schlauchverbindungen zu / von der Bühne-Top-Inkubator und Aquarium Pumpe Gehäuse) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Messing Schnellkupplungen (für Schlauchverbindungen zu / von der Bühne-Top-Inkubator) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Messing Schnellkupplungen (für Schlauchverbindungen zu / von der Bühne-Top-Inkubator) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Stage-top-Inkubator Teilen: <table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm Glasboden-Schalen </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Lipid-reichen BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-Prolin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> Vitamin B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations

Um zu verstehen, die Beziehung zwischen mitochondrialen Transport und neuronale Funktion, ist es entscheidend, mitochondriale Verhalten in lebenden kultivierten Neuronen für längere Laufzeiten 1-3 beobachten. Dies ist nun durch den Einsatz von vitaler Farbstoffe und fluoreszierende Proteine, mit denen Zytoskelett-Komponenten, Organellen und anderen Strukturen in lebenden Zellen markiert und dann visualisiert werden können durch dynamische Fluoreszenz-Mikroskopie möglich. Zum Beispiel, in embryonalen Huhn sympathischen Neuronen wurde mitochondrialen Bewegung charakterisiert die vitalen Farbstoff Rhodamin 123 4. In einer anderen Studie wurden Mitochondrien visualisiert in Rattenvorderhirn Neuronen durch Transfektion von mitochondrial gezielte EYFP 5. Jedoch stellt Bildgebung von primären Neuronen über Minuten, Stunden oder sogar Tage eine Reihe von Fragen. An erster Stelle sind: 1) Pflege der Kultur, wie Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert während langer Imaging-Sitzungen, 2) eine starke, stabile Fluoreszenz-Signal, um sowohl die Qualität der aufgenommenen Bilder und genaue Messung der Signalintensität während der Bildanalyse zu gewährleisten; und 3) die Begrenzung der Exposition Mal während der Bildaufnahme zu minimieren Bleichen und zur Vermeidung von Phototoxizität. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Beobachtung, Visualisierung und Analyse der mitochondrialen Bewegung in kultivierten Hippocampus-Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung und unter optimalen Lebens unterstützen Bedingungen erlaubt. Wir haben eine erschwingliche Bühne-Top-Inkubator, dass eine gute Temperaturregelung und atmosphärischen Gasstrom bietet gebaut, und schränkt auch den Grad der Medien Verdunstung, versicherte stabilen pH-Wert und Osmolarität. Dieser Inkubator ist über Ein-und Auslass-Schläuche, um eine Standard-Gewebekultur-Inkubator, der konstante Luftfeuchtigkeit und eine Atmosphäre von 5-10% CO 2 / Luft bietet. Diese Konstruktion bietet eine kostengünstige Alternative zu wesentlich teureren Mikroskop Inkubatoren, die nicht unbedingt versichern die Lebensfähigkeit der Zellen über viele Stunden oder sogar Tage. Zur Visualisierung Mitochondrien, infizieren wir Zellen mit einem Lentivirus kodierend für ein rot fluoreszierendes Protein, das an den Mitochondrien abzielt. Dies sichert eine starke und anhaltende Signal, das in Verbindung mit dem Einsatz eines stabilen Xenon-Lichtquelle, ermöglicht es uns, Belichtungszeiten während der Bildaufnahme zu begrenzen und alle, aber schließt Bleichen und Phototoxizität. Zwei Einspritzöffnungen am oberen Rand der Bühne-Top-Inkubator ermöglicht die akute Verabreichung von Neurotransmittern und anderen Reagenzien bestimmt zu modulieren mitochondrialen Bewegung. In der Summe Lentivirus-vermittelte Expression von einer Organelle gezielte rot fluoreszierendes Protein und die Kombination unserer Bühne-Top-Inkubator, eine konventionelle invertierten Fluoreszenzmikroskop, CCD-Kamera und Xenon-Lichtquelle ermöglichen es uns, Zeitraffer-Bilder der mitochondrialen Transport in erwerben lebenden Neuronen über lange Zeiträume als möglich in Studien den Einsatz konventioneller Vitalfarbstoffen und off-the-shelf lebenserhaltenden Systemen.

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Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Wir beschreiben ein Protokoll, das Bildgebung von Mitochondrien ermöglicht in lebenden Nervenzellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie über einen längeren Zeitraum. Imaging über längere Zeiträume durch Lentivirus-vermittelte Expression von mitochondrial gezielte fluoreszierendes Protein und Verwendung eines kostengünstigen Bühne-Top-Inkubator, entworfen und gebaut wurde in unserem Labor durchgeführt.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

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Forschung

Neurowissenschaften

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

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A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

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Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

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Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...