Name: neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00
Duration: 4 min 50 s
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Vorremmo ringraziare Donald Hutson per aver contribuito la sua competenza tecnica e grande abilità durante la progettazione e la realizzazione della fase-top-incubatore. Siamo anche grati a Ayda Dashtaei per la sua eccellente assistenza tecnica. Tutto il lavoro è stato sostenuto dal Neurosciences Research Foundation.

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	<li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons.">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li><li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria.">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li><li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in neuroscience. , (1999).</li><li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for neural cell culture. , (2001).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons.">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Impiegando lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mirata ai mitocondri in infetti neuroni coltivati ​​e un poco costoso laboratorio di un palco allestito-top incubatore che permette l&#39;imaging di cellule vive per periodi estesi, siamo stati in grado di indagare il legame tra movimento mitocondriale e segnali neuromodulatori , come la serotonina (5-HT), dopamina (DA) e acetilcolina (ACh). I nostri studi hanno permesso di chiarire una via di segnalazione che, per la prima volta, i collegamenti il ​​traffico di mitocondriali ai cambiamenti nell&#39;attività dei neuroni-modulata da neurotrasmettitori come la 5-HT e DA - che sono al centro della funzione neurale. Troviamo che l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti mirato permette l&#39;osservazione dei mitocondri etichettate in vita i neuroni in coltura per lunghi periodi che possono essere fisiologicamente più rilevanti rispetto alla durata molto più breve che sono possibili utilizzando coloranti vitali. Inoltre, l&#39;intensità del segnale proteina fluorescente ci permette di mantenere tempi di esposizione brevi durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine, riducendo al minimo la possibilità di photobleaching o fototossicità. Infine, uno stadio-top semplice e poco costoso incubatore che mantiene la temperatura ambiente, umidità e livelli di CO 2, riducendo al minimo l&#39;evaporazione dei media, ci permette di seguire il movimento mitocondriale in vita i neuroni nel giro di ore o anche giorni. I ricercatori che desiderano fabbricare un palcoscenico superiore incubatore per le osservazioni a lungo termine dei mitocondri dei neuroni vivere non è necessario seguire i dettagli precisi del nostro design, a condizione che le proprietà dei materiali utilizzati (ad esempio, membrana permeabile ai gas per evitare l&#39;evaporazione dei media ) ei principi applicati (ad esempio, il controllo della temperatura e dell&#39;umidità, tamponamento del pH, della manutenzione di osmolarità) sono generalmente in linea con quanto descritto in questo protocollo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Quantità </th><th> Descrizione (e della posizione in Figura 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Incubatore di coltura tissutale (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Resistente al calore custodia in plastica (delrin o comparabili) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Telaio in plastica per il coperchio 35 millimetri GBM (per l&#39;apposizione della membrana a scatola di Petri) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> lineare ft chiaro PTFE (Teflon) membrana di materiale </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Viti in ottone pollice </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Piccole resistenze dissipatore 10kOhm (utilizzati come elementi di riscaldamento all&#39;interno di stage-superiore della custodia incubatore) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Trasformatore (fornitura di corrente da 9V a resistenze) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrario regolatore di temperatura e sonda (regolazione termostatica del potere di resistenze dissipatore tramite trasformatore) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Beuta (marmitta per la soppressione delle vibrazioni nel tubo prima fase-top incubatore) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;foglio sorbotano (materiale della guarnizione per la base del palco-top incubatore) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ABS a tenuta d&#39;aria (o assimilabili) scatola di plastica (alloggiamento per la pompa dell&#39;acquario) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Acquario di pompa (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Piccola ventola di raffreddamento del computer </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Contenitore in plastica per la ventola di raffreddamento (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Trasformatore 9V per la ventola di raffreddamento del computer </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Nalgene o tubi silicone (collegamento tra la cultura del tessuto e stadio-top incubatori; trappole umidità) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rubinetti in plastica (per aprire e chiudere il flusso d&#39;aria prima e dopo la fase-top incubatore) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Spinato ottone raccordi per tubi flessibili (per i collegamenti dei tubi per / da stadio-top incubatore e corpo pompa acquario) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Accoppiatori rapidi in ottone (per connessioni tubo da / per stage-top incubatore) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Accoppiatori rapidi in ottone (per connessioni tubo da / per stage-top incubatore) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Stage-top incubatore parti: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminina </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 millimetri con fondo di vetro piatti </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Ricchi di lipidi BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> La vitamina B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations

Per capire il rapporto tra trasporto mitocondriale e la funzione neuronale, è importante osservare il comportamento mitocondriale in vivo neuroni in coltura per la durata estesa 1-3. Questo è ora possibile attraverso l&#39;utilizzo di coloranti vitali e delle proteine ​​fluorescenti con cui i componenti del citoscheletro, organelli e altre strutture nelle cellule viventi possono essere etichettati e poi visualizzati tramite dinamica microscopia a fluorescenza. Per esempio, embrioni di pollo nei neuroni simpatici, il movimento dei mitocondri è stato caratterizzato utilizzando il colorante vitale rodamina 123 4. In un altro studio, i mitocondri sono stati visualizzati nei neuroni del proencefalo ratto mediante trasfezione di mitocondri mirati eYFP 5. Tuttavia, l&#39;imaging di neuroni primari più minuti, ore o addirittura giorni presenta una serie di questioni. Tra questi sono: 1) mantenimento delle condizioni di coltura, quali temperatura, umidità e pH durante lunghe sessioni di imaging, 2) un segnale forte e stabile fluorescente per garantire sia la qualità delle immagini acquisite e misurazione precisa di intensità del segnale durante l&#39;analisi delle immagini; e 3) limitare i tempi di esposizione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine per minimizzare ed evitare photobleaching fototossicità. Qui, descriviamo un protocollo che permette l&#39;osservazione, la visualizzazione e l&#39;analisi del movimento mitocondriale in colture di neuroni dell&#39;ippocampo con alta risoluzione temporale e in condizioni ottimali di supporto vitale. Abbiamo costruito un acquistabile fase-top incubatore che fornisce una buona regolazione della temperatura e il flusso dei gas atmosferici, e limita anche il grado di evaporazione media, assicurando il pH stabile e osmolarità. Questa incubatrice è collegato, tramite tubi di alimentazione e scarico, ad una cultura incubatore standard di tessuto, che fornisce livelli di umidità costante e un&#39;atmosfera di 5-10% di CO 2 / aria. Questo progetto offre una conveniente alternativa agli incubatori microscopio molto più costosi che non necessariamente garantiscono la vitalità delle cellule di molte ore o anche giorni. Per visualizzare i mitocondri, che infettano le cellule con un lentivirus che codifica per una proteina fluorescente rossa che si rivolge al mitocondrio. Questo assicura un segnale forte e persistente, che, in concomitanza con l&#39;uso di una stabile fonte di luce allo xeno, ci permette di limitare i tempi di esposizione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e di tutti, ma preclude photobleaching e fototossicità. Due porte di iniezione sulla parte superiore del palco-top incubatore consente la somministrazione acuta di neurotrasmettitori e altri reagenti destinati a modulare il movimento mitocondriale. In sintesi, lentivirus-mediata espressione di un organello mirati proteina fluorescente rossa e la combinazione del nostro stadio-top-incubatore, un microscopio invertito a fluorescenza convenzionale, telecamera CCD, e la sorgente di luce allo xeno ci permettono di acquisire immagini time-lapse di trasporto mitocondriale in neuroni vita nei periodi più lunghi rispetto a quelli possibili negli studi di distribuzione convenzionali coloranti vitali e off-the-shelf sistemi di supporto vitale.

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Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Noi descriviamo un protocollo che permette l&#39;imaging di mitocondri in vita i neuroni tramite microscopia a fluorescenza su durate lunghe. Imaging per lunghi periodi si realizza attraverso lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mitocondri mirata e l&#39;uso di un poco costoso stadio-top incubatore che è stato progettato e costruito nel nostro laboratorio.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

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