Name: neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00
Duration: 4 min 50 s
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Gostaríamos de agradecer Donald Hutson para contribuir seus conhecimentos técnicos e muita habilidade durante o projeto e fabricação da incubadora em estágio superior. Estamos também gratos a Ayda Dashtaei por sua excelente assistência técnica. Todo o trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Neurociências.

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	<li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons.">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li><li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria.">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li><li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in neuroscience. , (1999).</li><li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for neural cell culture. , (2001).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons.">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Empregando lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente alvejado a mitocôndria em neurônios cultivados infectados e uma incubadora barata laboratório construído estágio-top que permite imagens de células vivas por longos períodos, temos sido capazes de investigar a ligação entre o movimento mitocondrial e os sinais de neuromoduladores , como a serotonina (5-HT), dopamina (DA) e acetilcolina (ACh). Nossos estudos têm ajudado a elucidar uma via de sinalização que, pela primeira vez, links tráfico mitocondrial para mudanças na atividade dos neurônios-modulado por neurotransmissores como a 5-HT e DA - que são o cerne da função neural. Nós achamos que o uso de proteínas fluorescentes alvo permite a observação de mitocôndrias rotulados na vida neurônios cultivados por longos períodos que podem ser mais fisiologicamente relevante do que a duração muito mais curta que são possíveis usando corantes vitais. Além disso, a intensidade do sinal de uma proteína fluorescente nos permite manter os tempos de exposição curtos durante a aquisição de imagem, minimizando a possibilidade de fotodegradação ou fototoxicidade. Finalmente, um estágio-top simples e barato incubadora que mantém a temperatura ambiente, umidade e níveis de CO 2, enquanto minimiza a evaporação da mídia, nos permite acompanhar o movimento mitocondrial em neurônios vivos por horas ou mesmo dias. Pesquisadores que desejam fabricar uma incubadora de estágio-top para as observações a longo prazo de mitocôndrias nos neurônios viver não precisa seguir os detalhes precisos do nosso projeto, desde que as propriedades dos materiais utilizados (por exemplo, o gás membrana permeável para evitar a evaporação da mídia ) e os princípios aplicados (por exemplo, controle de temperatura e umidade, o buffer de manutenção do pH, da osmolaridade) são geralmente consistentes com o que é descrito neste protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Quantidade </th><th> Descrição (e localização na Figura 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Cultura de tecidos incubadora (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Resistente ao calor gabinete plástico (delrin ou comparáveis) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Armação de plástico para 35mm tampa GBM (para a aposição de membrana para placa de Petri) (M) </td></tr><tr><td> 02/01 </td><td> linear pé Limpar PFTE material da membrana (Teflon) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Polegar parafusos de latão </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Pequena 10kOhm resistores dissipador de calor (usados ​​como elementos de aquecimento no interior estágio-top gabinete incubadora) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformador (fonte de corrente 9V para resistores) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrário controlador de temperatura e sonda (regulação termostática de poder para resistores dissipador de calor através de transformador) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyer (silenciador para a supressão de vibração na mangueira antes da fase-top incubadora) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;folha Sorbothane (junta material para base de estágio-top incubadora) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hermético ABS (ou comparável) caixa de plástico (carcaça para a bomba de aquário) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Aquário da bomba (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ventilador pequeno computador </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Invólucro de plástico para ventilador de arrefecimento (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V transformador para computador ventoinha de refrigeração </td></tr><tr><td> 20-30 pés </td><td> Nalgene ou silicone mangueira (conexões entre cultura de tecidos e-top estágio incubadoras; armadilhas umidade) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Torneiras de plástico (para abrir e fechar o fluxo de ar antes e depois do estágio-top incubadora) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Conectores de bronze farpado mangueira (mangueira para conexões de / para o estágio-top incubadora e gabinete de bomba de aquário) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Acopladores de bronze rápida (para conexões de mangueira de / para o estágio-top incubadora) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Acopladores de bronze rápida (para conexões de mangueira de / para o estágio-top incubadora) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Stage-top incubadora feita com partes: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5mg </td></tr><tr><td> laminina </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 milímetros com fundo de vidro pratos </td><td> Mattek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Rica em lipídios BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-Proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> A vitamina B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100mg </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100mg </td></tr></tbody></table>

neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations

Para entender a relação entre o transporte mitocondrial e função neuronal, é fundamental observar o comportamento mitocondrial em viver neurônios cultivados por longos períodos 1-3. Isto é agora possível através do uso de corantes vitais e proteínas fluorescentes com que os componentes do citoesqueleto, organelas, e outras estruturas em células vivas podem ser rotulados e então visualizados através de microscopia de fluorescência dinâmica. Por exemplo, nos neurônios de frango embrionárias Simpático, movimento mitocondrial foi caracterizada utilizando o corante vital rodamina 123 4. Em outro estudo, as mitocôndrias foram visualizados nos neurônios do prosencéfalo rato por transfecção de eYFP mitochondrially alvo 5. No entanto, imaging de neurônios primários ao longo de minutos, horas ou mesmo dias apresenta uma série de questões. Lugar entre estes estão: 1) manutenção das condições de cultivo, como temperatura, umidade e pH durante as sessões de imagem longa, 2) um forte sinal estável fluorescentes para garantir a qualidade das imagens adquiridas e medição precisa da intensidade do sinal durante a análise de imagem; e 3) limitar tempos de exposição durante a aquisição de imagens para minimizar e evitar fotobranqueamento fototoxicidade. Aqui, nós descrevemos um protocolo que permite a observação, visualização e análise do movimento mitocondrial em culturas de neurônios do hipocampo com alta resolução temporal e sob condições de apoio ótima vida. Temos construído um preço acessível estágio-top incubadora que fornece boa regulação da temperatura e fluxo de gás na atmosfera, e também limita o grau de evaporação media, assegurando pH estável e osmolaridade. Esta incubadora é conectado, via de entrada e saída de mangueiras, com um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que oferece níveis de umidade constante e uma atmosfera de CO% 05-10 fevereiro de ar /. Este projeto oferece uma alternativa de baixo custo para incubadoras microscópio significativamente mais caros que não necessariamente garantem a viabilidade das células durante muitas horas ou mesmo dias. Para visualizar as mitocôndrias, que infectar as células com um lentivírus que codifica uma proteína fluorescente vermelha que é direcionado para a mitocôndria. Isso garante um sinal forte e persistente, que, em conjunto com o uso de uma fonte estável de luz xenon, que nos permite limitar tempos de exposição durante a aquisição de imagem e tudo, mas impede fotobranqueamento e fototoxicidade. Duas portas de injeção na parte superior da incubadora estágio-top permitir que a administração aguda de neurotransmissores e outros reagentes destinados para modular o movimento mitocondrial. Na expressão de soma, mediada por lentivírus de uma organela-alvo a proteína fluorescente vermelha ea combinação de nosso palco-top incubadora, um microscópio invertido de fluorescência convencional, câmera CCD, e fonte de luz xenon nos permitem adquirir imagens de lapso de tempo de transporte mitocondrial em neurônios vivos mais durações mais longas do que as possíveis em estudos a implantação convencional corantes vitais e off-the-shelf sistemas de suporte de vida.

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Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neurociência

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...