Name: neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations at JoVE.com

Biz Donald Hutson teknik uzmanlık ve büyük bir beceri sahne top kuluçka tasarım ve üretim sırasında yaptığı katkı için teşekkür etmek istiyorum. Biz de onu mükemmel bir teknik yardım için Ayda Dashtaei minnettarız. Tüm çalışmalar, Nörobilim Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons.">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li><li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria.">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li><li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons.">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in neuroscience. , (1999).</li><li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for neural cell culture. , (2001).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons.">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li><li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li></ol>

Lentivirüs enfekte kültürlü nöronlar mitokondri hedefleyen bir floresan protein aracılı ifade ve uzun süreler için canlı hücreleri görüntüleme sağlayan bir ucuz laboratuvar inşa aşamasında üst inkübatör istihdam, mitokondriyal hareket ve nöromodülatör sinyalleri arasındaki bağlantıyı araştırmak için mümkün olmuştur serotonin (5-HT), dopamin (DA), asetilkolin (Ach) gibi. Sinir fonksiyon kalp çalışmalar ilk kez, 5-HT ve DA nörotransmitterler nöronlar modülasyonlu aktivite değişiklikleri mitokondriyal kaçakçılığı bağlantılar, sinyal yolağı aydınlatmak için yardımcı oldu. Biz hedefli floresan proteinleri kültürlü nöronların fizyolojik ilgili hayati boyalar kullanarak mümkün olan çok kısa süreleri daha uzun süre boyunca yaşayan etiketli mitokondri gözlem izin verdiğini bulabilirsiniz. Ayrıca, floresan protein sinyal yoğunluğu photobleaching veya fototoksisite olasılığını en aza indirerek, görüntü alımı sırasında bize poz süreleri kısa tutmak için izin verir. Son olarak, basit ve ucuz bir sahne üst inkübatör medya buharlaşma en aza indirerek, ortam sıcaklığı, nem ve CO 2 düzeyleri korur, bize saat ya da gün içinde bile yaşam nöronlar mitokondriyal hareketini takip sağlar . Canlı nöronlarda mitokondri uzun vadeli gözlemler için bir sahne üstü inkübatör imal etmek isteyen araştırmacılar koşuluyla, tasarım kesin ayrıntıları izleyin gerekmez medya buharlaşmasını önlemek için (örneğin, gaz geçirgen bir zar kullanılır malzemelerin özellikleri ) ve (örneğin, sıcaklık ve nem kontrolü, pH, bakım ozmolarite tamponlama) uygulanan ilkeler, bu protokol açıklanan ne ile tutarlı.

<table border="1"><tbody><tr><th> Miktar </th><th> Açıklama (Şekil 1 Yer ve) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Doku kültürü inkübatör (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Isıya dayanıklı plastik muhafaza (delrin veya eşdeğeri) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 35mm GBM kapağı için plastik çerçeve (petri membran iliştirilmesi için) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> doğrusal ft Clear PFTE (Teflon) membran malzemesi </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Pirinç parmak vida </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Küçük 10kOhm soğutucu dirençleri (sahne top inkübatör muhafaza içinde ısıtma elemanları olarak kullanılır) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Trafo (9V mevcut arz dirençler için) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrarium sıcaklık kontrolörü ve prob (soğutucu dirençler güç trafosu üzerinden termostatik düzenleme) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyer şişesi (susturucu hortum önce sahne top inkübatör titreşim önleme için) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;sorbothane sheet (sahne üst inkübatör baz conta malzemesi) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hava geçirmez ABS (veya eşdeğeri) plastik kutu (akvaryum pompası için konut) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Akvaryum pompası (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Küçük bilgisayar soğutma fanı </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Soğutma fanı Plastik muhafaza (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V bilgisayar trafo soğutma fanı </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Nalgene veya silikon hortum (doku kültürü ve sahne üstü inkübatörler arasındaki bağlantıları, nem tuzakları) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Plastik stopcocks (evre-üst inkübatör öncesi ve sonrası hava akışını açmak ve kapatmak için) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Dikenli pirinç hortum bağlantısı (hortum bağlantıları için / sahne top kuvöz ve akvaryum pompası muhafaza) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Pirinç hızlı kuplörler (hortum bağlantıları için / sahne top inkübatör) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Pirinç hızlı kuplörler (hortum bağlantıları için / sahne top inkübatör) </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sahne üstü inkübatör parçalar: <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Poly-D-lizin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminin </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm cam alt yemekleri </td><td> Mattek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Lipid-zengin BSA </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-prolin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> Vitamin B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100mg </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromokriptin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100mg </td></tr></tbody></table>

neuromodulation and mitochondrial transport: live imaging in hippocampal neurons over long durations

Mitokondriyal ulaşım ve nöronal fonksiyonu arasındaki ilişkiyi anlamak için, 1-3 uzun süreler için canlı kültürlü nöronlar mitokondriyal davranışlarını gözlemlemek için kritik öneme sahiptir. Bu iskelet parçaları, organeller ve canlı hücrelerin diğer yapıların dinamik floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir sonra etiketli ve hangi hayati boyalar ve floresan proteinlerle kullanımı ile artık mümkün. Örneğin, embriyonik tavuk sempatik nöronlar, mitokondriyal hareket hayati boya rodamin 123 4 ile karakterize edildi. Başka bir çalışmada, mitokondri mitochondrially hedef eYFP 5 transfeksiyon sıçan önbeyin nöronları görüntülendi. Ancak, bir takım konularda bile birincil dakika içinde nöronlar, saat veya gün görüntüleme sunar. Bunların başında: 1) uzun görüntüleme oturumları sırasında, sıcaklık, nem, ve pH gibi kültür koşullarında bakım, 2) elde edilen görüntü ve görüntü analizi sırasında sinyal yoğunluğu doğru ölçüm kalitesini sağlamak için güçlü, istikrarlı bir floresan sinyal; 3) görüntü alımı sırasında pozlama süreleri sınırlayıcı photobleaching en aza indirmek ve fototoksisite önlemek. Burada, gözlem, görselleştirme ve yüksek temporal çözünürlük ve uygun yaşam destek koşulları altında kültürlü hipokampal nöronlarda mitokondriyal hareketin analizi izin veren bir protokol açıklar. Biz, iyi bir ısı düzenleme ve atmosferik gaz akışı sağlayan uygun bir sahne top inkübatör inşa edilmiş, ve aynı zamanda kararlı pH ve osmolarite temin medya buharlaşma derecesi sınırlar var. Bu inkübatör, sabit sıcaklık ve nem seviyeleri ve% 5-10 CO 2 / hava bir atmosfer sağlayan standart bir doku kültürü inkübatör, giriş ve çıkış hortumları ile bağlı . Bu tasarım, mutlaka uzun saatler hatta günler içinde hücre canlılığı sağlamak önemli ölçüde daha pahalı mikroskop inkübatörler bir düşük maliyetli bir alternatif sunmaktadır. Mitokondri görselleştirmek için, biz, mitokondri hedeflenen bir kırmızı floresan proteini kodlayan bir lentivirüs hücreleri enfekte. Bu istikrarlı bir xenon ışık kaynağı kullanımı ile birlikte, görüntü alımı sırasında pozlama süresini sınırlamak için bize izin verir ve tüm ama photobleaching ve fototoksisite engeller, kalıcı ve güçlü bir sinyal sağlar. İki enjeksiyon noktaları sahne top kuluçka üstüne amaçlanan nörotransmitter ve diğer reaktifler akut yönetim mitokondriyal hareketi modüle izin verir. Toplamı, bir organel hedefli kırmızı floresan proteini ve sahne üstü inkübatör, geleneksel bir ters floresan mikroskop, CCD kamera ve xenon ışık kaynağı kombinasyonu lentivirüs aracılı ifade bizimle mitokondriyal ulaşım zaman atlamalı görüntüler elde etmek için izin geleneksel hayati boyalar ve off-the-raf ömrü destek sistemleri dağıtımı çalışmalar mümkün olan daha uzun bir süre boyunca yaşayan nöronlar.

Watch this Scientific Journal Video about Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations at JoVE.com

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Biz uzun bir süre boyunca floresan mikroskobu ile yaşam nöronlar mitokondri görüntüleme sağlayan bir protokol açıklar. Uzun süre üzerinden Görüntüleme mitochondrially hedef floresan protein ve laboratuvarımızda tasarlanmış ve inşa edilmiştir ucuz bir sahne top inkübatör kullanımı lentivirüs aracılı ifade aracılığıyla gerçekleştirilir.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Nörobilim

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...