Name: a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures at JoVE.com

Studier sponsrade av AdvanDx.

1. Provtagning och förberedelser <ol><li> Samla venöst blod från patienter som misstänks för sepsis och tas i två Bactec (BD, Sparks, MD) blododling flaskor, en aerob och en anaerob, tillsammans omfattande en uppsättning blododling. </li><li> Placera flaskorna i Bactec 9240 instrumentet på 35 ° C. </li><li> Inkubera tills instrumentet utlöser ett larm på grund av tillväxt av organismer i blododling flaskan. </li><li> Ta bort flaskan från blododling instrumentet. </li></ol> 2. Beredning av reagenser innan färgning <ol><li> Bered tvättlösningen genom att tillsätta 4 mL 60x Tvättlösning följt av 240 ml rent avjoniserat eller destillerat vatten direkt till färgning skålen. </li><li> Sätt färgning skålen i 55 ° C vattenbad till varmt. </li><li> Förvara de återstående koncentrera vid 2-8 ° C. </li><li> Ta bort Montering Medel ur kylskåpet och värmas upp till rumstemperatur. </li></ol> 3. Gram färgning <ol><li> Snurra flaskan blododling. </li><li> Med hjälp av en nål och spruta eller en subkultur apparater, tvätta bort blodet (ca 5 ml) från flaskan och placera i ett sterilt skruv tak rör. </li><li> Använd en steril pipett, placera en stor droppe blod på ett glas objektglas. </li><li> Lufttorka i bilden och fixa i metanol i 10 sekunder. </li><li> Låt bilden lufttorka. </li><li> Gör en gramfärgning på blod filmen för att bestämma morfologi av organismen växer i blodet kulturen flaskan. </li><li> Använda en lins oljeimmersion, visa bildspel. Grampositiva kocker i par och korta kedjor observerats på gramfärgning stämmer bäst överens med Enterococcus arter. </li><li> Detta gramfärgning resultatet driver sedan valet av rätt PNA FISH Probe Kit använda för bakteriell identifiering. Detta blododling kommer färgas med E. faecalis / OE PNA FISH fläcken. </li></ol> 4. PNA FISH Stain <ol><li> Blanda röret med blod försiktigt genom att snurra innan smutskasta beredning. </li><li> Placera en droppe Fixering lösningen på väl om en PNA FISH objektglas. </li><li> Överför 10 mikroliter eller en liten droppe ur röret med positiv blododling till upptagningen lösning och blanda försiktigt så emulgera. </li><li> Fäst utstryk genom att värma dem i 20 min. vid 55 ° C på en värmeplatta. </li></ol> 5. Kvalitetskontroll Material En positiv och en negativ kvalitetskontroll bilden måste testas med varje sats diabilder för missfärgning. <ol><li> Använd E. faecalis / OE kontrollglas köpts från AdvanDx för detta ändamål eller förbereda utstryk från flytande kulturer av referens stammar av E. faecalis och E. faecium som positiv kontroll, antingen på separata diabilder eller blandas på en bild och Staphylococcus spp. eller Streptococcus spp. som negativa kontrollmaterial. </li></ol> QC resultat bör kunna övervaka lämpliga testmetoder, särskilt de som berör hybridisering stringens och cellväggen penetration, eftersom PNA metodiken är utformad för att optimera penetration cellväggen 6. Hybridisering <ol><li> Tillsätt en droppe E. faecalis / OE PNA till brunnen på objektglas med cellprov. </li><li> Lägg täckglas. Undvik luftbubblor. </li><li> Inkubera i 30 ± 5 minuter. vid 55 ± 1 ° C på värmeplatta </li><li> Efter inkubation placera bilder i bilden bärare </li></ol> 7. Strikta Tvätta <ol><li> Sänk bilden bärare i den förvärmda tvättlösningen vid 55 ° C och försiktigt bort täckglas. Ofta glider täckglas bort genom att försiktigt skaka bilden i tvättlösningen. Ibland måste täckglas försiktigt knuffade bort med pincett. </li><li> Inkubera i tvättlösningen i 30 ± 5 minuter. vid 55 ± 1 ° C. </li><li> Ta bort bilderna från den tvättlösning </li><li> Låt bilden lufttorka </li></ol> 8. Montering <ol><li> Tillsätt en droppe monteringsmedium i varje bild </li><li> Lägg täckglas. Undvik luftbubblor. </li><li> Undersök glida på en fluorescensmikroskop inom 2 timmar. </li><li> Utsätt inte glider för direkt solljus eller andra starka ljuskällor, eftersom detta kan leda till fluorescens härdning. </li></ol> 9. Tolkning av resultat Den fluorescensmikroskop används för att glida undersökning skall vara utrustade med AdvanDx Dual Band Filter och en 60x eller 100x olja mål. QC glider bör undersökas först för att bekräfta att hybridisering skedde. E. faecalis ska visas som ljusa gröna fluorescerande kocker i flera synfält och E. faecium visas som röda kocker. Icke-enterokocker kontroll bilden ska visas nonfluorescent. Efter att ha bekräftat systemet i kontroller, kan patienten glider undersökas. Vid första blodet film kommer att visas rödaktiga men den ljusa röda och gröna kocker kommer att vara ganska uppenbart. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Representativa exempel på grön-positiva E. faecalis (vänster), röd positiv E. faecium (mitten) och negativa (höger) testresultat. 10. Representativa resultat Tre institutionerna ingick i en multicenter klinisk studie som utvärderar detta PNA FISH fläcken och jämför en 2,5 timme protokoll till förkortade 1,5 timme protokoll som precis har granskats. Totalt 152 rutin grampositiva kocker i par och kedjor (GPC) var positiv blododling flaskor som ingår i studierna. Det var 100% (152/152) Avtal mellan resultaten av de ändrade och den ursprungliga analysen förfarande för E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis, 33/33 andra enterokocker och 78/78 andra GPC (tabell 1). Denna färgningsmetod hade utsökt känslighet och specificitet under denna studie (tabell 2). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Rutinmetoder </td><td> E. faecalis / OE PNA FISH Standardförfarande </td><td> E. faecalis / OE PNA FISH Kort Förfarande </td></tr><tr><td> E. faecalis </td><td> 41 </td><td> 41 (Grön positiv) </td><td> 41 (Grön positiv) </td></tr><tr><td> E. faecium </td><td> 27 </td><td> 27 (Röd positiv) </td><td> 27 (Röd positiv) </td></tr><tr><td> E. casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (Röd positiv) </td><td> 2 (Röd positiv) </td></tr><tr><td> E. gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (Röd positiv) </td><td> 2 (Röd positiv) </td></tr><tr><td> Andra Enterococcus spp.. </td><td> 2 </td><td> 2 (Röd positiv) </td><td> 2 (Röd positiv) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td> 17 </td><td> 17 (Negativ) </td><td> 17 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (Negativ) </td><td> 33 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (Negativ) </td><td> 1 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (Negativ) </td><td> 3 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. bovis </td><td> 2 </td><td> 2 (Negativ) </td><td> 2 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (Negativ) </td><td> 1 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (Negativ) </td><td> 2 (Negativ) </td></tr><tr><td> S. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (Negativ) </td><td> 7 (Negativ) </td></tr><tr><td> Andra Streptococcus spp.. </td><td> 7 </td><td> 7 (Negativ) </td><td> 7 (Negativ) </td></tr><tr><td> Abiotrophia SPP. </td><td> 3 </td><td> 3 (Negativ) </td><td> 3 (Negativ) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus SPP. </td><td> 2 </td><td> 2 (Negativ) </td><td> 2 (Negativ) </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 152 </td><td> 152/152 100%-avtalet </td><td> 152/152 100%-avtalet </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Notering av bakterier testades med både standard (2.5hr) och snabb (1,5 h) protokollet. <table border="1"><tbody><tr><td> Känslighet E.faecalis </td><td> Känslighet Andra Enterococcus spp.. </td><td> Specificitet </td></tr><tr><td> 100% (41/41) 95% CI (93,0-100) </td><td> 100% (33/33) 33/33 95% CI (91,3-100) </td><td> 100% (78/78) 95% CI (96,2-100) </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Sensitivitet och specificitet på 1,5 timme PNA FISH protokoll.

<ol>
	<li>Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures+by+dual+color+fluorescence+in+situ+hybridization+using+PNA+probes.">Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes.</a> , (2002).</li><li>Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+E.+faecalis+PNA+FISH+for+rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures.">Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures.</a> , (2003).</li><li>Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+Staphylococcus+aureus,+Enterococcus+faecalis,+and+Candida+albicans+from+blood+cultures+using+fluorescence+in+situ+hybridization+with+nucleic+acid+probes.">Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes.</a> , (2005).</li><li>Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+S.+aureus+PNA+FISH,+E.+faecalis+PNA+FISH+&#38;+C.+albicans+PNA+FISH+for+Rapid+Identification+of+Positive+Blood+Culture+Bottles.">Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH &#38; C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles.</a> , (2006).</li><li>Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+of+Enterococcus+Species+in+Positive+Blood+Cultures+with+Therapeutic+Implications.">Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications.</a> , (2006).</li></ol>

Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av AdvanDx. Benjamin Crystal är anställd AdvanDx, som gör verktyg och reagens som används i denna artikel.

E. faecalis / OE PNA FISH analys för Enterococcus kan ge identifiering 2-3 dagar tidigare än vanliga kulturen metoder. Den förkortade förfarande för analysen (1,5 hourr) ger snabb identifiering som kan användas för ett bättre förhållningssätt till antimikrobiell behandling och patientens resultat. En studie för att stödja detta utfördes av Forrest, et al. (6). Under två på varandra följande år med början år 2005 mikrobiologiska laboratoriet identifierat grampositiva kocker i par och kedjor växer i flaskor blododling med konventionella mikrobiologiska metoder och under 2006 lägga till E. faecalis / OE PNA FISH. Förutom en behandling algoritm som utvecklats av institutionerna antimikrobiella team (AMT) att effektivt använda PNA FISH data som genereras av laboratoriet i god tid. Primärt utfall bedöms var tiden från blododling dra till genomförandet av effektiva antimikrobiell behandling före och efter PNA FISH instiftades i laboratorier arbetsflöde. Svårighetsgraden av sjukdomen, patientens läge och empirisk antimikrobiell behandling mättes. Totalt 224 patienter med vårdrelaterade enterococcal bakteriemi utvärderades med 129 i före interventionsperioden och 95 PNA FISH period. PNA FISH identifierade E. faecalis 3 dagar tidigare än traditionella kulturer (1,1 vs 4,1 dagar, p &lt;0,001). PNA FISH identifierade E. faecium en median 2,3 dagar tidigare (1,1 vs 3,4 dagar, p &lt;0,001) och var förknippat med statistiskt signifikanta sänkningar i tid för att initiera effektiv terapi (1,3 vs 3,1 dagar, p &lt;0,001) och minskade 30 dagar mortalitet (26% vs 45%, p = 0,04). Denna grupp slutsatsen att E. faecalis / OE PNA FISH-analys i kombination med en AMT behandling algoritm resulterade i tidigare insättande av lämplig empirisk antimikrobiell behandling för patienter med vårdrelaterade E. faecium bakteriemi. <ol><li> Reagenser får inte användas efter utgångsdatum tryckt på etiketterna och reagenser inte bör ändras på något sätt. De bör vara kvar i kylskåpet när den inte används eller om de kan förlora potens. </li><li> Blododling flaskor måste blandas före provtagningen. </li><li> Det är viktigt att inte tillåta pipetten flaskans spets vidröra ett blodutstryk eftersom det kan orsaka korskontaminering av material mellan bilder, eller orsaka kontaminering av reagens. </li><li> Se till vattenbadet och värmeblocket hålls på en konstant 55 ° C. </li><li> Använd inte filter än de Dual Band Filter eller färger kommer inte att vara tydligt urskiljas. </li><li> Använd inte objektglas än Objektglas eller hybridisering kommer inte att inträffa. </li><li> Det är viktigt att mikroskop fungerar. Se till att mikroskopet lampan är inom den godkända antalet timmar för användning. </li></ol><ul><li> Några sällsynta förekommande Enterococcus arter är inte upptäcks av PNA sonden hybridisering med andra Enterococcus arter, såsom E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius och E . svavelhaltiga. </li><li> E. moraviensis identifieras som E. faecalis grund sekvens likheter. </li><li> Vissa stammar av Streptococcus anginosus ge en falsk grön positiv fluorescens grund sekvens likheter. </li><li> VersaTREK blododling flaskor har inte utvärderats i kliniska studier. Föreställningen att upptäcka E. faecalis och andra Enterococcus spp.. med VersaTREK flaskor blododling är okänd. </li><li> Falskt positiva gröna autofluorescens kan uppstå om en standard FITC-filter används i stället för Dual Band Filter. </li><li> Falskt negativa resultat kan sällan uppstå på grund av blandade tillväxt eller på grund av fel i analysen teknik. </li><li> Den typ och skick av använda instrument kommer att påverka utseendet på de erhållna bilden. Den fluorescens kan varydue till den typ av mikroskop som används, ljuskällan och nivån av rRNA i cellerna </li><li> Isolering på fasta medier behövs för att skilja blandas tillväxt med andra organismer och för att identifiera positiva blododlingar ger ett negativt resultat. </li><li> Produkten har inte validerats med andra exemplar än blododlingar. </li></ul>

Reagenser E. faecalis / OE PNA FISH består av följande kitkomponenter: <ul><li> Fixering Lösning Fixering Lösning 3 ml fosfatbuffrad koksaltlösning med diskmedel. </li><li> E. faecalis / OE PNA E. faecalis / OE PNA 1,5 ml PNA sonder i hybridisering. lösning. Innehåller 30% formamid. </li><li> 60x Tvättlösning 60x tvättlösning 50 ml Tris-buffrad saltlösning med diskmedel </li><li> Monteringsmedium Montering Medium 3 ml fotoblekning hämmare i glycerol </li><li> Kvalitetskontroll diabilder </li><li> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures

Enterokocker är en vanlig orsak till bakteriemi med E. faecalis är den dominerande arten följt av E. faecium. Eftersom resistens mot ampicillin och vankomycin i E. faecalis fortfarande är ovanligt jämfört med motstånd i E. faecium, är utvecklingen av snabbtest tillåta differentiering mellan enterococcal arter viktig för lämplig behandling och motstånd övervakning. E. faecalis OE PNA FISH analys (AdvanDx, Boston, MA) använder artspecifika syra peptid nukleinsyra (PNA) sonder i en fluorescens in situ hybridisering format och ger en tid att resultat på 1,5 timmar och den potential att ge viktig information för artspecifika behandling. Multicenter studier utfördes för att utvärdera resultaten av den 1,5 timme E. faecalis / OE PNA FISH förfarande jämfört med den ursprungliga 2,5 timme analysprocedur och till standard bakteriologi metoder för identifiering av enterokocker direkt från en positiv blododling flaska.

Watch this Scientific Journal Video about A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures at JoVE.com

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

En snabb protokoll för direkt identifiering av Enterococcus faecalis och andra arter Enterococcus från en positiv blododling med hjälp av en peptid nukleinsyra fluorescent in situ hybridisering analys (PNA fisk).

Ett 1,5 timme Förfarande för identifikation av Enterococcus Arter Direkt från blododlingar

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Program för bakteriell patogen Detection och provning av antimikrobiell resistens från blododlingar

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Rutiner för att identifiera smittsamma prioner efter passage genom matsmältningssystemet av en fågelart

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generering och identifiering av GM-CSF Derived Alveolära liknande makrofager och dendritiska celler från benmärg från mus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...