Name: whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Nous remercions K. Gill de l&#39;aide pour l&#39;élevage de souris et de soins et de gestion de laboratoire. Merci également à Mukoyama membres du laboratoire de l&#39;aide technique. Le financement a été fourni par le Programme de recherche intra-muros des Instituts Naitonal de la Santé.

1. Collecte peau Limb embryonnaires de souris (E13.5 E17.5 ~) <ol><li> Euthanasier branchée femelles par une procédure approuvée. Selon notre protocole animales approuvées, les femelles sont euthanasiés par le CO 2 d&#39;exposition et ensuite assurée par dislocation cervicale. Lay l&#39;animal sur son papier absorbant et les tremper complètement dans 70% EtOH / H 2 O à partir d&#39;un flacon souple. </li><li> Disséquer l&#39;utérus intact et le placer dans un plat de 100 x 15 mm de Petr...

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4.">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li><li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development.">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li></ol>

Le système vasculaire est crucial pour le développement des organes pendant l&#39;embryogenèse ainsi que pour l&#39;entretien des organes et des fonctions de reproduction chez les adultes, car il fournit suffisamment d&#39;oxygène et de nutriments aux organes. Une bonne réseau vasculaire est bien établie avec des processus complexes et multi-étapes par l&#39;angiogenèse dans lequel pré-existante du réseau capillaire est réorganisée avec des structures très ramifiées et hiérarchique. Bien que de nombreux t...

Anticorps Marqueur des cellules endothéliales pan- <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Hamster arménien (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Dilution 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 dilution </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 dilution </td></tr><tr><td> Le collagène IV </td><td> Lapin (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 dilution # 2 </td></tr></tbody></table> Artérielle marqueur des cellules endothéliales <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Lapin (P) </td><td> Le Kolodkin Alex Lab # 3 </td><td></td><td> 1:3000 dilution </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Chèvre (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Marqueur de cellules endothéliales veineuses <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Chèvre (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> Dilution 1:100 </td></tr></tbody></table> Marqueur des cellules endothéliales lymphatiques <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Lapin (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Lapin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> Dilution de 1:1000 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Chèvre (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> Dilution 1:50 </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Lapin (P) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 de dilution </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Hamster syrien (M) </td><td> Hybridomes Bank </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Lisse des cellules musculaires / péricytes marqueur <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Souris (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 dilution # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Lapin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Lapin (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Anticorps pour rapporteur GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Lapin (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 dilution </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai Tesque </td><td> 04404-84 </td><td> Dilution de 1:1000 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 dilution </td></tr></tbody></table> Anticorps pour rapporteur LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Lapin (P) </td><td> MP Biomédical </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 dilution </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chèvre (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 dilution </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Anticorps pour axone périphériques <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Souris (M) # 7 </td><td> Hybridomes Bank </td><td> 2H3 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Souris (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 dilution </td></tr><tr><td> Périphérine </td><td> Lapin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> Dilution de 1:1000 </td></tr></tbody></table> Anticorps pour la migration des cellules de Schwann <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Lapin (P) </td><td> Le laboratoire de Thomas Müller # 9 </td><td></td><td> 1:3000 dilution </td></tr></tbody></table> (P): anticorps polyclonal, (M): anticorps monoclonal # 1: chèvre anti-arménienne de hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) anticorps doit être utilisé comme anticorps secondaire. # 2: L&#39;anticorps de collagène IV peut être utilisé pour détecter des vaisseaux sanguins après l&#39;hybridation in situ. # 3: L&#39;anticorps Neuropilin1 est aimablement fourni par le laboratoire de l&#39;Kolodkin Alex à l&#39;Université Johns Hopkins. Sheep anticorps anti-humain Neuropilin1 est disponible en R &amp; D (AF3870), bien que nous n&#39;avons pas encore testé. # 4: Les anticorps LYVE-1 également détecter un sous-ensemble des macrophages dans la peau embryonnaire. # 5: L&#39;anticorps anti-IgG2a de souris αSMA est un anticorps monoclonal. # 6: L&#39;anticorps conjugué Cy3 αSMA est incubé pendant 1 heure à température ambiante avec s.Anticorps secondaires pour d&#39;autres anticorps primaires. # 7: 2H3 anticorps est la souris anticorps monoclonal IgG1 contre les neurofilaments. # 8: Tuj1 anticorps est IgG2a de souris d&#39;anticorps monoclonaux contre le neurone-spécifique de classe III bêta-tubuline. # 9: Le BFABP (cerveau-spécifiques d&#39;acides gras binding protein) antibody est aimablement fourni par le laboratoire de l&#39;Müller Thomas à Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo

Whole-Mont analyse immunohistochimique pour l&#39;imagerie du système vasculaire entier est essentielle pour la compréhension des mécanismes cellulaires de ramification morphogenèse. Nous avons développé le modèle de la vascularisation des membres de peau pour étudier le développement vasculaire dans lequel un pré-existante primitive plexus capillaire est réorganisée dans un réseau hiérarchiquement ramifiée vasculaire. Whole-Mont microscopie confocale avec étiquetage multiple permet pour l&#39;imagerie des vaisseaux sanguins robustes intactes ainsi que leurs composants cellulaires dont les cellules endothéliales, péricytes et cellules musculaires lisses, en utilisant des marqueurs fluorescents spécifiques. Les progrès dans ce modèle la vascularisation des membres peau avec des études génétiques ont permis d&#39;améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du développement vasculaire et les motifs. Le modèle vascularisation des membres peau a été utilisée pour étudier comment les nerfs périphériques fournissent un modèle spatial pour la différenciation et la structuration des artères. Cet article décrit un protocole vidéo simple et robuste pour colorer les vaisseaux sanguins intacts avec des anticorps spécifiques et vasculaires anticorps secondaires fluorescents, qui est applicable pour les organes embryonnaires vascularisées où nous sommes en mesure de suivre le processus du développement vasculaire.

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Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Nous introduisons une immunohistochimie toute monture et laser microscopie confocale à balayage avec un étiquetage multiple pour analyser la formation de complexes réseau vasculaire dans la peau de souris membres de l&#39;embryon.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

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Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

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Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

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Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analyse de l&#39;apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...