Name: whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Agradecemos a K. Gill para a assistência com a criação do mouse e os cuidados e para a gestão de laboratório. Agradeço também aos membros Mukoyama laboratório para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos de Saúde Naitonal.

1. Coleta de rato Pele Limb embrionárias (E13.5 E17.5 ~) <ol><li> Euthanize conectado fêmeas através de um procedimento aprovado. De acordo com nosso protocolo aprovado animais, as fêmeas são sacrificados por exposição ao CO 2 e, em seguida, assegurada por deslocamento cervical. Lay o animal à sua toalha de papel absorvente e deixe-o completamente em 70% EtOH / H 2 O de uma garrafa squeeze. </li><li> Dissecar o útero intacto e coloque-o em um prato 100 15 mm x Petri contendo solução ge...

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4.">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li><li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development.">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li></ol>

O sistema vascular é fundamental para o desenvolvimento do órgão durante a embriogênese, bem como para a manutenção de órgãos e funções reprodutivas nos adultos, pois fornece oxigênio e nutrientes suficientes para os órgãos. Rede vascular adequada é bem estabelecido com processos complexos e multi-passo a angiogênese em que o pré-existentes da rede capilar é reorganizada com estruturas altamente ramificada e hierarquizada. Apesar de inúmeros trabalhos têm demonstrado que uma variedade de moléculas es...

Anticorpos Pan-endotelial marcador de células <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Hamster Armenian (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Diluição 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 diluição </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 diluição </td></tr><tr><td> Colágeno IV </td><td> Coelho (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 diluição # 2 </td></tr></tbody></table> Marcador de células endoteliais arteriais <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Coelho (P) </td><td> O laboratório Kolodkin Alex # 3 </td><td></td><td> 1:3000 diluição </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Bode (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Venosa marcador de células endoteliais <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Bode (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> Diluição 1:100 </td></tr></tbody></table> Linfática marcador de células endoteliais <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> Lyve-1 # 4 </td><td> Coelho (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Lyve-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Coelho (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Bode (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 01:50 diluição </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Coelho (P) </td><td> Sinalização celular </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 de diluição </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Hamster sírio (M) </td><td> Hibridoma Banco </td><td> 8.1.1 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Músculo liso marcador de células / pericyte <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Mouse (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 diluição # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Coelho (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Coelho (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpos para repórter GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Coelho (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 diluição </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 diluição </td></tr></tbody></table> Anticorpos para repórter LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Coelho (P) </td><td> MP Biomédica </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 diluição </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Bode (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 diluição </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpos para axônio periférico <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Espécies </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Condição de trabalho </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Mouse (M) # 7 </td><td> Hibridoma Banco </td><td> 2H3 </td><td> Diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Mouse (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 diluição </td></tr><tr><td> Periferina </td><td> Coelho (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 diluição </td></tr></tbody></table> Anticorpos para as células de Schwann migrando <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Coelho (P) </td><td> O laboratório de Thomas Müller # 9 </td><td></td><td> 1:3000 diluição </td></tr></tbody></table> (P): anticorpo policlonal, (M): anticorpo monoclonal # 1: Goat anti-armênio hamster-Cy3 anticorpos (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) deve ser usado como um anticorpo secundário. # 2: O Colágeno IV anticorpos podem ser usados ​​para detectar os vasos sanguíneos após a hibridização in situ. # 3: O anticorpo Neuropilin1 é gentilmente cedidas pelo laboratório do Kolodkin Alex na Johns Hopkins University. Ovelhas anti-anticorpo humano Neuropilin1 está disponível em P &amp; D (AF3870), embora não tenha testado ainda. # 4: Os anticorpos lyve-1 também detectar um subconjunto de macrófagos na pele embrionárias. # 5: O anticorpo anti-rato αSMA é anticorpo monoclonal IgG2a. # 6: O Cy3-conjugados de anticorpos αSMA é incubada por 1 hora à temperatura ambiente, juntamente com secanticorpos secundária para outros anticorpos primários. # 7: 2H3 anticorpo é rato anticorpo IgG1 monoclonal contra neurofilamento. # 8: Tuj1 anticorpo é rato de anticorpos monoclonais contra IgG2a Neuron-specific classe III beta-tubulina. # 9: O BFABP anticorpos (cérebro-específica de ácidos graxos binding protein) é gentilmente cedidas pelo laboratório do Thomas Müller em Max-Delbrück-Center de Medicina Molecular.

whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo

Todo-mount análise imunohistoquímica para a imagem latente toda a vasculatura é fundamental para a compreensão dos mecanismos celulares de ramificação morfogênese. Nós desenvolvemos o membro modelo vascularização da pele para estudar o desenvolvimento vascular em que um pré-existentes primitiva do plexo capilar é reorganizado em uma rede hierarquicamente ramificada vascular. Todo-mount microscopia confocal com rotulagem múltiplos permite imagem robusta dos vasos sanguíneos intacta, assim como seus componentes celulares, incluindo células endoteliais, pericitos e células musculares lisas, usando marcadores fluorescentes específicos. Avanços neste modelo vasculatura membro pele com estudos genéticos têm melhorado a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular e padronização. O membro modelo vasculatura da pele tem sido usada para estudar como os nervos periféricos fornecer um modelo espacial para a diferenciação e padronização das artérias. Este artigo descreve um protocolo de vídeo simples e robusto para corar vasos sanguíneos vascular intacto com anticorpos específicos e fluorescentes anticorpos secundários, que é aplicável para os órgãos vascularizados embrionárias, onde somos capazes de acompanhar o processo de desenvolvimento vascular.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de Ramificação

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...