Name: whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Vi tackar K. Gill för hjälp med mus uppfödning och vård och för laboratorie-ledningen. Tack också till Mukoyama lab medlemmar för teknisk hjälp. Finansieringen kom från Interna forskningsprogram Naitonal Institutes of Health.

1. Samla Mus Embryonala Limb Skin (E13.5 ~ E17.5) <ol><li> Euthanize ansluten honor av godkända proceduren. Enligt vår godkända djur protokollet, honorna euthanized av CO 2 exponering och sedan säkerställs av halsdislokation. Lägg djuret när det absorberande pappersduk och blöt den ordentligt i 70% EtOH / H 2 O från en sprutflaska. </li><li> Dissekera livmodern intakt och placera den i en 100 x 15 mm petriskål med iskall Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) att tvätta bort blod. </li><l...

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4.">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li><li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development.">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li></ol>

Kärlsystemet är avgörande för organutveckling under fosterutvecklingen samt för orgel underhåll och fortplantningsförmågan hos vuxna, eftersom det levererar tillräckligt med syre och näring till organen. Korrekt vaskulära nätverket är väletablerat med komplexa och multi-processer genom angiogenes där befintliga kapillära nätet är organiserat med mycket grenade och hierarkiska strukturer. Trots att många verk har visat att en mängd olika molekyler som är inblandade i dessa processer, har det inte var...

Antikroppar Pan-endotel markör <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Armeniska hamster (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 utspädning # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553.369 </td><td> 1:300 utspädning </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 utspädning </td></tr><tr><td> Kollagen IV </td><td> Kanin (P) </td><td> ABD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 utspädning # 2 </td></tr></tbody></table> Arteriell endotelceller markör <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Kanin (P) </td><td> The Alex Kolodkin labb # 3 </td><td></td><td> 1:3000 utspädning </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Goat (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr></tbody></table> Venös endotelceller markör <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Goat (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> 1:100 utspädning </td></tr></tbody></table> Lymfatisk endotelceller markör <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Kanin (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Kanin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 utspädning </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Goat (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50 utspädning </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Kanin (P) </td><td> Cellsignalering </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 utspädning </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Syriska hamstern (M) </td><td> Hybridom Bank </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr></tbody></table> Smooth muscle cells / pericyte markör <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> αSMA-CY3 </td><td> Mus (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 utspädning # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Kanin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Kanin (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr></tbody></table> Antikroppar för GFP reporter <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Kanin (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 utspädning </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04.404-84 </td><td> 1:1000 utspädning </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 utspädning </td></tr></tbody></table> Antikroppar för LacZ reporter <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Kanin (P) </td><td> MP Biomedical </td><td> 55.976 </td><td> 1:5000 utspädning </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Goat (P) </td><td> ABD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 utspädning </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr></tbody></table> Antikroppar för perifera Axon <table border="1"><tbody><tr><td> Antikropp </td><td> Arter </td><td> Företag </td><td> Catalogue # </td><td> Skick </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Mus (M) # 7 </td><td> Hybridom Bank </td><td> 2H3 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Mus (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 utspädning </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> Kanin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 utspädning </td></tr></tbody></table> Antikroppar för att migrera Schwann celler <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Kanin (P) </td><td> Thomas Müller labb # 9 </td><td></td><td> 1:3000 utspädning </td></tr></tbody></table> (P): polyklonala antikroppar, (M): monoklonal antikropp # 1: Goat anti-armeniska hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160)-antikroppar bör användas som en sekundär antikropp. # 2: Kollagen IV Antikroppen kan användas för att upptäcka blodkärl efter in situ hybridisering. # 3: Neuropilin1 Antikroppen är vänligt tillhandahålls av Alex Kolodkin labb i Johns Hopkins University. Får anti-human Neuropilin1 antikroppar finns i FoU (AF3870), även om vi inte har testat det än. # 4: LYVE-1-antikroppar upptäcka också en delmängd av makrofager i embryonala huden. # 5: Den anti-αSMA antikropp är mus IgG2a monoklonal antikropp. # 6: Cy3-konjugerade αSMA antikropp är inkuberas under 1 timme i rumstemperatur tillsammans med sekondary antikroppar för andra primära antikroppar. # 7: 2H3 antikropp är mus IgG1 monoklonal antikropp mot neurofilament. # 8: Tuj1 antikropp är mus IgG2a monoklonal antikropp mot Neuron-specifik klass III beta-tubulin. # 9: BFABP (brain-specifika fettsyror bindande protein) antikropp är vänligt tillhandahålls av Thomas Müllers labb i Max-Delbrück-Centrum för Molekylär Medicin.

whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo

Hela montering immunhistokemiska analyser för att avbilda hela kärlsystemet är avgörande för att förstå de cellulära mekanismer förgrening morfogenes. Vi har utvecklat extremiteten modell huden kärlsystemet att studera vaskulär utveckling där en befintlig primitiva kapillär plexus ombildas till ett hierarkiskt förgrenad vaskulär nätverk. Hela montering konfokalmikroskopi med flera märkning möjliggör robusta avbildning av intakta blodkärl samt deras cellulära komponenter inklusive endotelceller, pericyter och smidig muskelceller, med specifika fluorescerande markörer. Framsteg inom denna delgrund huden kärlsystemet modell med genetiska studier har ökat förståelsen molekylära mekanismer av vaskulära utveckling och mönster. Extremiteten huden kärlsystemet modell har använts för att studera hur perifera nerver ger en rumslig mall för differentiering och mönstring av artärer. Denna video artikeln beskrivs en enkel och robust protokoll för att färga intakta blodkärl med vaskulär specifika antikroppar och fluorescerande sekundära antikroppar, som är tillämplig för vaskulariserad embryonala organ där vi kan följa processen av vaskulära utveckling.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Vi introducerar en hel-fäste immunohistokemi och laserskanning konfokalmikroskopi med flera märkning för att analysera invecklade vaskulära nätverk bildas i möss embryonala lem hud.

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Mus embryonala Lung kultur, ett system för att utvärdera de molekylära mekanismerna för Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mouse embryonala utveckling i ett serumfritt Hela Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analys av apoptos i Zebrafish embryon genom Hela montering Immunofluorescence att upptäcka Aktiverad Caspas 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...