Name: associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions at JoVE.com

We danken Adelle Murell en Wolf Reik hartelijk voor het delen van hun 3C protocol. Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie en de Research Service van het Department of Veterans Affairs.

1. Formaldehyde fixatie van lange-afstands chromatine interacties <ol><li> Cultuur menselijke cellijn HL-60 in RPMI1640 medium met 15% FBS en 1 x penicilline / streptomycine tot 80-90% confluentie in een incubator geleverd met 5% CO 2 bij 37 ° C. </li><li> Het verzamelen van de cellen in een 50 ml buis Nunc, centrifugeer bij 1200 rpm gedurende 15 minuten, en verwijder het medium door aspiratie </li><li> Voeg 5 ml kweekmedium aan de cel pellets resuspenderen, en de cellen met behulp van een hemocytometer tellen. Duurt ongeveer 1 x 10 7 cellen tot een volume van 40 ml met RPMI1640 / 10% FBS, voeg vervolgens 1,7 ml 37% formaldehyde om de verdunde chromatine op te lossen. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten onder zacht schudden, en dan blussen met 2,4 ml 2M glycine. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1200 rpm bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Zodra Was de pellet met 40 ml ijskoude PBS, dan spin down van de pellet en verwijder de PBS. </li></ol> 2. Cellysis om kernen te isoleren <ol><li> Resuspendeer cellen in 40 ml ijskoud lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) met vers toegevoegde proteaseremmers (1:500 verdunning) en 0,1 mM PMSF. Incubeer in een koude ruimte met de rotatie van 90 minuten, centrifugeer bij 2500 rpm gedurende 15 minuten, en verwijder het supernatant. </li></ol> 3. Restrictie-enzym digestie met Bgl II <ol><li> Resuspendeer de kernen in 0,5 ml 1 x NEB buffer 3, en voeg 15 μlof 10% SDS. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur met schudden, en voeg 45 ul van 20% Triton X-100 aan de SDS sekwestreren. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur met schudden. </li><li> Gebruik een hoeveelheid van 1 x 10 6 kernen (ongeveer 15 ug, een tiende van de oorspronkelijke cellen) voor de restrictie-enzym spijsvertering. Neem 55 ul van kernen oplossing van stap 3.1 en vul aan tot 500 pi met 433 ul van 1 x NEB buffer 3 en 12 pl van BGL II (50U/ul). Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. </li></ol> 4. Ligatie van interactie DNA-segmenten <ol><li> Inactiveren het restrictie-enzym door het toevoegen van 95 pi van 10% SDS, en denatureren door verhitting bij 65 ° C gedurende 20 minuten in een waterbad. </li><li> Voeg 7 ml 1 x ligatie buffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) en 360 ul van 20% Triton X-100 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur . </li><li> Verlaag de temperatuur tot 16 ° C en voeg 50 ul van 400 U / ul T4 DNA-ligase. Incubeer het monster bij 16 ° C gedurende 4 uur en daarna bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li></ol> 5. DNA-zuivering <ol><li> Voeg 300 ug van proteinase K, en incubeer bij 65 ° C gedurende de nacht. </li><li> Voeg 5 ug van RNase A en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten </li><li> Zuiver DNA door fenol / chloroform extractie, en neerslag DNA in isopropanol. Los DNA in 150 pi steriel gedistilleerd water. </li></ol> 6. Spijsvertering met MSP I en ligatie met oligonucleotide linkers <ol><li> Incubeer 2μg gezuiverd DNA met vijf eenheden van MSP ik bij 37 ° C gedurende 4-6 uur. Inactiveren MSP ik bij 65 ° C gedurende 10 minuten, dan neerslag het DNA in ethanol met 1 pl van 5 mg / ml glycogeen. Los van de DNA-pellet in 50 ul steriel gedistilleerd water. </li><li> Meng 50 ul van MSP I-DNA behandeld met 2 pi van een 20 pM linker oligonucleotide L (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &#39;), 1 ui van een 20 pM oligonucleotide S (5&#39;-cggtgaatc-3&#39;), 1 ui steriel gedestilleerd water en 6 pi van 10 x T4 DNA-ligase buffer. Bedek het mengsel met vloeibare was. </li><li> Denatureren oligonucleotiden bij 50 ° C gedurende 1 minuut en laat geleidelijk afkoelen tot 10 ° C in een 0,5 ° C / minuut gradiënt in een thermische cycler. </li><li> Voeg 1 ui van 400 U / ul T4 DNA-ligase en incubeer bij 15 ° C gedurende de nacht. Zuiveren de linker-geligeerde DNA met behulp van een QIAquick PCR zuivering kit, en elueren in 50 ul van steriel gedistilleerd water. </li></ol> 7. PCR-amplificatie en sequentie-analyse <ol><li> Kies een primer voor de specifieke regio van DNA die u wenst te onderzoeken op lange afstand interacties (dat wil zeggen het &#39;lokaas&#39;). In dit voorbeeld gebruiken we ABL-1. </li><li> Neem een ui van het gezuiverde DNA naar de eerste ronde PCR met behulp van een ui van 20 uM ABL -1 specifieke primer # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &#39;), 1 ui van 20 uM linker specifieke primer # 2.963 (uitvoeren van 5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &#39;), 3μl van 3 x Klen Taq DNA-polymerase I cocktail en 3 pi steriel gedistilleerd water. Twee pi van 32 P-dCTP wordt toegevoegd aan 100 ul van 3 x Klen Taq DNA-polymerase I cocktail voor PCR-amplificatie. De thermische cyclus voor een warme start PCR is 72 ° C gedurende 2 min, 95 ° Cfor 2 minuten, 18 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden, 65 ° C gedurende 40 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut, de laatste verlenging wordt uitgevoerd bij 72 ° Cgedurende 5 minuten. </li><li> Zuiveren de eerste ronde PCR-producten met behulp van een QIAquick PCR zuivering kit, en elueer DNA in 30 pi van steriel gedistilleerd water. </li><li> Neem een pi van 100 x verdund eerste PCR product dat een tweede ronde van PCR met geneste primers uit te voeren door het toevoegen van een pi van 20 uM ABL-1-specifieke primer # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &#39;) (figuur 1a), 1 ui van 20 uM van linker specifieke primer # 2.961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &#39;), 3 pl van 3 x Klen Taq DNA-polymerase I cocktail en 3 pi steriel gedistilleerd water. De thermische fietsen schema is 25 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden, 67 ° C gedurende 40 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut, gevolgd door een extensie bij 72 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Visualiseer de PCR-producten door het uitvoeren van een 5% ureum-PAGE-gel en het scannen van de blootgestelde scherm in een PhosphoImager (Figuur 1b). Elke PCR-band kan worden gerecycled uit de gel door het oplossen van de gel strips in een Eppendorf buisje met 60 pi van steriel gedestilleerd water, en incuberen bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Centrifugeer kort bij 10.000 rpm gedurende 10 seconden om alle monsters te verzamelen. Verwijder een ui te gebruiken als de DNA-template aan PCR met de primerpaar 2961/4626 met dezelfde voorwaarden als hierboven beschreven uit te voeren. Sequentie-analyse kan worden uitgevoerd na zuivering met behulp van een QIAquick PCR Purification kit. </li><li> DNA-sequenties worden geanalyseerd met behulp van een online tool om hun chromosomale locatie op de website te bepalen: http://genome.ucsc.edu (Figuur 1c). Klik op &#39;BLAT&#39; om een ​​nieuw venster die het mogelijk maakt om te plakken een DNA-sequentie te voeren, een nieuw venster verschijnt na het klikken op &#39;submit&#39;, en toont de &#39;BLAT Search Results&#39;. Klik op &#39;browser&#39; van de hit met 100% identiteit aan een volgende venster in te voeren om de locatie van de DNA-sequentie te tonen. </li></ol> 8. Representatieve resultaten 1. ACT test met behulp van ABL-1 regio als lokaas om de lange afstand DNA interacties vast te stellen Zoals weergegeven in Figuur 1a, twee Bgl II sites en een BamH I site zijn gekozen voor de ACT-test. In de tweede ronde van PCR, primer set 4626/2961 werd gebruikt voor het ABL-M1 te versterken, werd 4630/2961 gebruikt voor ABL-M2, en 4636/2961 werd gebruikt voor ABL-M3. Een typisch gel patroon toont een tot enkele bands (Figuur 1b). Elk fragment van een ACT-test bestaat uit twee gecombineerde DNA-segmenten: een segment is afgeleid van het aas DNA-regio, terwijl het tweede segment komt van de geassocieerde partner, die aan het aas regio segment samen met de eerste restrictie-enzym herkenningssequentie. De tweede enzym herkenningssequentie zal verschijnen aan het einde van de geassocieerde partner volgorde (figuur 1c). De gekloonde ABL-M1 fragment bevat DNA van de regio van ABL1 ligt op chromosoom 9q32.4 van +133,592,306-133,592,399, en de bijbehorende partner is gelegen op chromosoom 3p13 van +71,869,882-71,870,107. De identiteit van de geassocieerde partners worden ontdekt door middel van stralen hun sequenties met behulp van de UCSC genoom browser (GRCh7/hg19 uitgebracht in februari 2009). PROK2 werd geïdentificeerd als de bijbehorende partner bij de chr3p13 locus. Ook was het ABL-M2 geassocieerd partner gelokaliseerd chr5q21.1, terwijl kloon ABL-M3 werd geïdentificeerd als een intra-chromosomale vereniging de buurt van de ABL-1 locus. 2. Het bepalen minder vaak voor lange afstand interacties met behulp van ACT-test Andere testen op basis van 3C hebben gemeld veel meer interagerende partners dan dat we hebben laten zien in figuur 1 en op de Igf2 / H19 locus 12. De methodologie die wij hebben geschetst selecteert de meest voorkomende lange afstand interacties. Echter, door toename van het aantal PCR-cycli, is het mogelijk om bijkomende, minder vaak associaties te identificeren en (figuur 2). 3. Verschillen in long range interacties in kankercellen in vergelijking met normale weefsels. De ACT-test kan ook worden gebruikt om verschillen in de nucleaire architectuur en de lange afstand interacties tussen normale cellen en kankercellen (figuur 3) te identificeren. Deze verschillen kunnen reflecteren nucleaire architectuur veranderingen die optreden tijdens de cel transformatie, en dus deze test kan uiteindelijk worden toegepast voor diagnostische doeleinden. De vergelijkbare gel patronen die zich voordoen in zowel de normale en kanker weefsels aangegeven dat de ACT-test is betrouwbaar en herhaalbaar. Terwijl de ACT-test kan identificeren lange reeks DNA-partners, verdere analyses, zoals fish and chips testen, zijn verplicht om de aanwezigheid van de geconstateerde verbanden tussen ver loci te controleren. Genetische, fysiologische en biochemische studies kan dan worden uitgevoerd om de biologische gevolgen van deze lange reeks DNA-verenigingen toe te lichten. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1 ACT test met behulp van ABL-1 regio als lokaas DNA in HL-60 cellen. a. DNA-structure in de ABL-1 regio. De eerste restrictie-enzym gebruikt in ACT-test was Bgl II. De primers voor de tweede ronde van PCR zijn ook gelabeld door middel van pijlen en bijbehorende primer nummers. b. Gel patroon van de ACT-test in 5% ureum-PAGE. Primerpaar 4626/2961 werd gebruikt voor het versterken kloon ABL-M1 in de geneste PCR, werd gebruikt voor 4630/2961 kloon ABL-M2, en 4636/2961 werd gebruikt voor kloon ABL-M3. c. DNA-sequentie van kloon ABL-M1. DNA-fragment van ABL-1 aas DNA is gelabeld in het rood, en de bijbehorende DNA-partner is geëtiketteerd in cyaan. Bgl II site (AGACTC) werd gelabeld in het groen, en MSP ik site (CCGG) is geëtiketteerd in paars. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2 PCR-cycli beïnvloeden ACT test resultaten. Met de imprint controle regio (ICR) van de Igf2/H19 locus als lokaas DNA in de muis fibroblast cellen, werden verschillende fietsen programma&#39;s die in de eerste en tweede ronde van PCR in het ACT-test. 18-20 cycli in de eerste ronde van PCR niet versterken genoeg signaal zichtbaar worden gemaakt. Twintig vijf cycli in de tweede PCR-resultaten in duidelijke banden, terwijl het verhogen van het aantal cycli voor de tweede ronde van PCR veroorzaakte een uitstrijkje patroon in aanvulling op meer bands. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3 Detectie van verschillen in de nucleaire architectuur tussen normale dikke darm weefsel en dikke darm kanker weefsel in ACT-test. A. DNA-structuur van de ICR regio op IGF2/H19 locus en IGF2-gen. DPN II sites voor ACT-test zijn gelabeld. Primers worden gebruikt in de tweede ronde PCR worden gelabeld door de pijlen en nummers in verschillende kleuren die overeenkomen met elke baan in het paneel onder b van de figuur. b. Gel patroon van de ACT-test in 5% ureum-PAGE. Normale dikke darm weefsel MAD03-1423-en darmkanker weefsel MAD04-149 werd verkregen van Coöperatieve Human Tissue Network (CHTN) West Division. Na elke dikke darm weefsel werd gehomogeniseerd, werd ACT test uitgevoerd volgens de procedures beschreven. Baan 1 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961and # 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &#39;) gemerkt in het roze in het paneel een, baan 2 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961 en # 4163 (5&#39;-gccgcgcggccacttccgattcc-3 &#39;) gemerkt in het oranje in het paneel een, baan 3 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961 en # 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3&#39;) gemerkt in het blauw in het paneel een; baan 4 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961 en # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &#39;) gemerkt in het groen in paneel A. Unieke bands die alleen verschijnen in de normale dikke darm weefsel worden gelabeld door gele pijlen, en die bands die alleen verscheen in darmkanker weefsel zijn geëtiketteerd in rode pijlen. ICR, imprinting controle regio, DMR, verschillende gemethyleerde regio.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

Dekker et al.. Ontwikkelde het chromosoom exterieur capture (3C) benadering van de frequentie van de interactie tussen twee genomische loci een te detecteren, en 3C is uitgebreid gebruikt voor het intra-chromosomale en inter-chromosomale associaties te onderzoeken tussen twee bekende DNA-regio&#39;s in zoogdiercellen 2 -9. Hoewel de nieuw ontwikkelde Hi-C methodiek kan worden toegepast voor de studie van het genoom-brede associatie DNA, ACT-test is nog steeds een effectieve techniek voor de studie van de locus-specifieke DNA-interactie 10-11. We hebben deze aanpak gewijzigd naar onbekende DNA-regio&#39;s die zijn gekoppeld aan een bekende DNA-regio in gekweekte muizen en menselijke cellen (figuur 1) te identificeren. We noemde deze methode de bijbehorende chromosoom val (ACT) test, want het heeft ons een betrouwbare en reproduceerbare methode om nieuwe onbekende DNA-partners die associëren met een bekende doel-DNA regio 12 te identificeren. Een succesvolle test met 3C nodige controles wordt uitgevoerd vóór het uitvoeren van de nieuwe aspecten van het ACT-test 13. Om tofind zo veel geassocieerd DNA regio&#39;s mogelijk te maken, is het noodzakelijk om verschillende combinaties van eerste en tweede restrictie-enzymen te gebruiken. Het is vooral belangrijk om restrictie-enzymen die ongevoelig zijn voor CpG methylering om de eerste 3C ligatie stap uit te voeren. De eiwitbinding en DNA-methylering kan ook van invloed zijn restrictie-enzym vertering efficiency en kan leiden tot het falen van ligatie van de bijbehorende DNA-regio&#39;s voor bepaalde restrictie-enzym ontsluitingen. Het optreden van intra-of inter-chromosomale ligatie is afhankelijk van eiwit-DNA cross-linking en passende fysieke kaarten van zowel van de bijbehorende DNA-regio&#39;s. Zo, enkele voorlopige experimenten zijn essentieel voor een effectieve praktisch formaldehyde concentratie en de duur van de behandeling te vestigen in de ACT-test. Een reeks van de uiteindelijke concentratie van formaldehyde (from1.5% tot 2%) werden gebruikt in verschillende labo&#39;s tijdens de 3C gedeelte van de test 7,9. Als alternatief kan de oligonucleotiden gebruikt als linkers worden ontworpen om het cohesieve uiteinde gesneden door de tweede restrictie-enzym wedstrijd. Hoewel wij vonden dat 18 tot 20 cycli in de eerste ronde van PCR en 20-25 cycli in de tweede ronde van PCR kon duidelijk bands te bieden, is het noodzakelijk om vast te stellen de beste PCR-condities voor elk experiment (figuur 2). Intra-molecuul gloeien tussen 5&#39;-uiteinde en het 3&#39;-uiteinde complementaire adapter sequentie van een DNA-streng kan optreden in PCR, het remt adapter-specifieke primer annealing met het DNA-molecuul, en resulteerde in veel lagere amplificatie-efficiëntie in de eerste paar cycli. Nadat het doel-DNA werd geamplificeerd voor cycli, kan het bedrag veel groter zijn dan deze niet-specifieke reacties, en kan de concurrentie van primer annealing om het doel DNA-moleculen te vergemakkelijken. Dat is ook de reden waarom wij achtergrond versterking te zien, en waarom de eerste ronde PCR-product moet worden verdund op de achtergrond amplification.It daling is het van belang om overtollig primers te verwijderen uit het PCR-reactie om de achtergrond daling in de tweede ronde van PCR. Zoals in alle PCR-gebaseerde experimenten, is het essentieel om het ontwerp primers die zich niet bevindt in herhaling reeks regio&#39;s, die de meerderheid van mens en muis DNA vormen. Hoewel de nieuw ontwikkelde Hi-C methodiek kan worden toegepast voor de studie van het genoom-brede associatie DNA, ACT-test is nog steeds een effectieve techniek voor de studie van de locus-specifieke DNA-interactie.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

Genetische informatie gecodeerd door DNA is georganiseerd in een complexe en sterk gereguleerd chromatine structuur. Elk chromosoom is gevestigd in een bepaald gebied, die kunnen veranderen afhankelijk van stadium van ontwikkeling of celcyclus. Genexpressie kan optreden in de gespecialiseerde transcriptionele fabrieken waar chromatine segmenten kunnen lus uit verschillende chromosoom gebieden, wat leidt tot co-lokalisatie van DNA segmenten die kunnen bestaan ​​op verschillende chromosomen of ver van elkaar op hetzelfde chromosoom. De Associated Chromosome Trap (ACT) assay is een effectieve methodiek om deze lange afstand DNA verenigingen in een onpartijdige wijze te identificeren door uitbreiding en wijziging van het chromosoom bouw vast te leggen techniek. De ACT-test maakt het mogelijk voor ons om te onderzoeken mechanismen van transcriptionele regulatie in trans, en kunnen helpen verklaren de relatie van nucleaire architectuur tot gen expressie in normale fysiologie en tijdens de ziekte staten.

Watch this Scientific Journal Video about Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions at JoVE.com

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

De bijbehorende chromosoom val (ACT) assay is een nieuwe onpartijdige methode voor het identificeren van lange-afstands-DNA interacties. De karakterisering van de lange reeks DNA-interacties zal ons toelaten om de relatie van de nucleaire architectuur vast te stellen om genexpressie in zowel de normale fysiologie en in zieke staten.

Associated Chromosoom Trap voor het vaststellen van lange afstand DNA-interacties

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

Damid-seq: Genoom-brede kaart brengen van eiwit-DNA-interacties door High Throughput Sequencing van adenine gemethyleerd DNA-fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...