Name: associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00
Duration: 14 min 49 s
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Wir bedanken uns Adelle Murell und Wolf Reik sehr viel für die gemeinsame Nutzung ihrer 3C-Protokoll. Diese Arbeit wurde vom Department of Defense und dem Research Service des Department of Veterans Affairs unterstützt.

1. Formaldehydfixierung von Langstrecken-Chromatin-Wechselwirkungen <ol><li> Kultur humanen Zelllinie HL-60 in RPMI1640 Medium mit 15% FBS und 1 x Penicillin / Streptomycin auf 80-90% Konfluenz in einem Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C geliefert </li><li> Sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml Nunc Röhrchen, Zentrifuge bei 1.200 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten, und entfernen Sie dann das Medium durch Absaugen </li><li> 5 ml Kulturmedium auf die Zellpellets resuspendiert, und zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Nehmen Sie ca. 1 x 10 7 Zellen auf ein Volumen von 40 ml mit RPMI1640 / 10% FBS, dann fügen Sie 1,7 ml 37% Formaldehyd zu der verdünnten Chromatin zu beheben. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter leichtem Schütteln und dann löschen mit 2,4 ml 2 M Glycin. Zentrifuge für 15 Minuten bei 1.200 rpm bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Waschen des Pellets einmal mit 40 ml eiskaltem PBS, dann drehen Sie den Pellets und entfernen Sie die PBS. </li></ol> 2. Zelllyse zu Kernen isolieren <ol><li> Die Zellen in 40 ml eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) mit frisch hinzu Protease-Inhibitoren (1:500 Verdünnung) und 0,1 mM PMSF. Inkubieren in einem kalten Raum mit Rotation für 90 Minuten, Zentrifuge bei 2.500 rpm für 15 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. </li></ol> 3. Restriktionsenzymverdau mit Bgl II <ol><li> Resuspendieren der Kerne in 0,5 ml 1 x NEB Puffer 3 und fügen Sie 15 μlof 10% SDS. Bei 37 ° C für 1 Stunde unter Schütteln, dann fügen Sie 45 ul von 20% Triton X-100 auf die SDS zu binden. Bei 37 ° C für 1 Stunde unter Schütteln. </li><li> Verwenden Sie ein Aliquot von 1 x 10 6 Kerne (ca. 15 pg, ein Zehntel der ursprünglichen Zellen) für Restriktionsenzymverdau. Nehmen Sie 55 ul der Kerne Lösung aus Schritt 3.1 und machen bis zu 500 ul mit 433 ul 1 x NEB Puffer 3 und 12 ul der Bgl II (50U/ul). Bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 4. Ligation von interagierenden DNA-Segmenten <ol><li> Inaktivierung des Restriktionsenzyms, indem 95 ul 10% SDS und denaturieren durch Erhitzen bei 65 ° C für 20 Minuten in einem Wasserbad. </li><li> 7 ml 1 x Ligation Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) und 360 ul 20% Triton X-100 und bei 37 ° C für 1 Stunde . </li><li> Senken Sie die Temperatur auf 16 ° C und 50 ul von 400 U / ul T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Probe bei 16 ° C für 4 Stunden und dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li></ol> 5. DNA Purification <ol><li> Add 300 ug Proteinase K, und inkubieren Sie bei 65 ° C über Nacht. </li><li> Add 5 ug RNase A und Inkubation bei 37 ° C für 30 Minuten </li><li> Purify DNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Fällung DNA in Isopropanol. Lösen DNA in 150 ul sterilem destilliertem Wasser. </li></ol> 6. Aufschluss mit Msp I und Ligation mit Oligonukleotid-Linker <ol><li> Inkubieren 2μg der gereinigten DNA mit 5 Einheiten Msp I bei 37 ° C für 4-6 Stunden. Inactivate Msp I bei 65 ° C für 10 Minuten, dann fallen die DNA in Ethanol mit 1 ul von 5 mg / ml Glykogen. Lösen Sie die DNA-Pellet in 50 ul sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Mix 50 ul Msp I-behandelter DNA mit 2 ul einer 20 uM Linker-Oligonukleotid L (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &#39;), 1 ul einer 20 uM Oligonukleotid S (5&#39;-cggtgaatc-3&#39;), 1 ul sterilem destilliertem Wasser und 6 ul 10 x T4 DNA-Ligase-Puffer. Decken Sie die Mischung mit flüssigem Wachs. </li><li> Denaturieren Oligonukleotide bei 50 ° C für 1 Minute und abkühlen lassen schrittweise auf 10 ° C in einer 0,5 ° C / Minute Gradienten in einem Thermocycler. </li><li> Add 1 ul 400 U / ul T4 DNA-Ligase und Inkubieren bei 15 ° C über Nacht. Purify der Linker-DNA ligiert mit einem QIAquick PCR Purification Kit und eluieren in 50 ul sterilem destilliertem Wasser. </li></ol> 7. PCR-Amplifikation und Sequenzanalyse <ol><li> Wählen Sie ein Primer für die spezifische DNA-Region, die Sie für langreichweitige Wechselwirkungen (dh der &quot;Köder&quot;) untersuchen möchten. In diesem Beispiel verwenden wir ABL-1. </li><li> Nehmen Sie 1 ul der gereinigten DNA in die erste Runde PCR mit 1 ul 20 uM ABL -1 spezifischen Primer # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &#39;), 1 ul 20 uM Linker spezifischen Primer # 2963 (durchführen 5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &#39;), 3μl von 3 x Klen Taq DNA Polymerase I Cocktail und 3 ul sterilem destilliertem Wasser. Zwei ul von 32 P-dCTP ist zu 100 ul 3 x Klen Taq DNA Polymerase I Cocktail vor dem PCR-Amplifikation aufgenommen. Die thermischen Zyklus für einen heißen Start-PCR liegt bei 72 ° C für 2 min, 95 ° Cfor 2 Minuten, 18 Zyklen von 95 ° C für 20 Sekunden, 65 ° C für 40 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute, die letzte Verlängerung ist bei 72 ° Cfür 5 Minuten. </li><li> Purify der ersten Runde PCR-Produkten mit einem QIAquick PCR Purification Kit, und eluieren DNA in 30 ul sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Nehmen Sie 1 ul 100 x verdünnt erste PCR-Produkt zu einem zweiten PCR-Runde mit verschachtelten Primer durch Zugabe von 1 ul 20 uM ABL-1-spezifischen Primer # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &#39;) (Abbildung 1a), 1 ul durchführen von 20 pM des Linkers spezifischen Primer # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &#39;), 3 ul 3 x Klen Taq DNA Polymerase I Cocktail und 3 ul sterilem destilliertem Wasser. Der Temperaturwechsel Zeitplan ist 25 Zyklen von 95 ° C für 20 Sekunden, 67 ° C für 40 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute, nach Verlängerung bei 72 ° C, gefolgt von 5 Minuten. </li><li> Visualisieren Sie die PCR-Produkte, indem Sie einen 5% Urea-PAGE-Gel und das Scannen der exponierten Bildschirm in einem Phosphoimager (Abb. 1b). Jeder PCR-Bande aus dem Gel durch Auflösen des Gels Streifen in ein Eppendorf-Röhrchen mit 60 ul sterilem destilliertem Wasser und Inkubation bei 95 ° C für 5 Minuten recycelt werden. Kurz zentrifugieren bei 10.000 rpm für 10 sec, um alle Proben zu sammeln. Nehmen Sie 1 ul als die DNA-Vorlage verwenden, um PCR mit dem Primerpaar 2961/4626 unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchführen. Die Sequenzanalyse können nach der Reinigung mit einem QIAquick PCR Purification Kit durchgeführt werden. </li><li> DNA-Sequenzen werden mit Hilfe eines Online-Tools, um ihre chromosomale Lage auf der Website zu ermitteln: http://genome.ucsc.edu (Abbildung 1c). Klicken Sie auf &quot;BLAT &#39;ein neues Fenster, das eine DNA-Sequenz einfügen können eingegeben haben, erscheint ein neues Fenster nach dem Klicken auf&#39; Senden &#39;und zeigt die&quot; BLAT Search Results&#39;. Klicken Sie auf &quot;Browser&quot; der Hit mit 100% Identität zu einer nächsten Fenster geben Sie den Speicherort der DNA-Sequenz zu zeigen. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse 1. ACT-Assay mit ABL-1 Region als Köder, um seiner großen Reichweite DNA Wechselwirkungen bestimmen Wie in Abbildung 1a, zwei Bgl II-und einer BamHI site dargestellt wurden für die ACT-Test ausgewählt. In der zweiten Runde der PCR, Primer-Set 4626/2961 verwendet wurde, um ABL-M1 zu verstärken, wurde 4630/2961 für ABL-M2 verwendet, und 4636/2961 war für die ABL-M3 verwendet. Ein typisches Gel Muster zeigt eine bis mehrere Banden (Abb. 1b). Jedes Fragment aus einem ACT-Test besteht aus zwei kombinierten DNA-Abschnitte: ein Segment aus dem Köder DNA-Region stammen, während das zweite Segment kommt aus den assoziierten Partner, der den Köder Region Segment durch die erste Restriktionsenzym-Erkennungssequenz verbunden war. Das zweite Enzym Erkennungssequenz wird am Ende der zugehörigen Partner-Sequenz (Abbildung 1c) erscheinen. Das geklonte ABL-M1-Fragment enthält DNA aus der Region auf Chromosom 9q32.4 ABL1 aus +133,592,306-133,592,399 befindet, und die damit verbundenen Partner ist auf Chromosom 3p13 aus +71,869,882-71,870,107 entfernt. Die Identitäten der beteiligten Partner sind durch Strahlen ihre Sequenzen mit der UCSC Genom-Browser (GRCh7/hg19 im Februar veröffentlicht, 2009) entdeckt. PROK2 als assoziierter Partner an der chr3p13 Locus identifiziert wurde. Ebenso wurde das ABL-M2 assoziierter Partner zu chr5q21.1 lokalisiert, während Klon ABL-M3 als intra-chromosomale Verein in der Nähe des ABL-1-Locus identifiziert wurde. 2. Bestimmen weniger verbreitet langreichweitige Wechselwirkungen mit ACT-Test Andere Tests auf Basis 3C haben viele weitere Interaktionspartner als dass wir in Abbildung 1 und in der Igf2 / H19-Locus 12 gezeigt gemeldet. Die Methode, die wir skizziert haben wählt die am weitesten verbreitete langreichweitige Wechselwirkungen. Doch durch die Erhöhung der Anzahl der PCR-Zyklen, ist es möglich, zusätzliche, weniger häufige Assoziationen zu identifizieren sowie (Abbildung 2). 3. Unterschiede in langreichweitige Wechselwirkungen in Krebszellen zu normalen Geweben verglichen. Der ACT-Test kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der nuklearen Architektur und langreichweitige Wechselwirkungen zwischen normalen und Krebszellen (Abbildung 3) zu identifizieren. Diese Unterschiede können reflektieren nuklearen Architektur Änderungen, die während Zelltransformation auftreten, und somit diesen Test kann letztlich gelten für diagnostische Zwecke. Die ähnliche Gel Muster, die in normalen und Krebsgewebe auftreten angedeutet, dass die ACT-Test zuverlässig und wiederholbar ist. Während die ACT-Assay identifizieren können Long Range DNA-Partner, weitere Analysen, wie zB Fisch-und Chip-Assays sind erforderlich, um die Anwesenheit der identifizierten Verbindungen zwischen entfernten Loci zu überprüfen. Genetische, physiologische und biochemische Untersuchungen können dann durchgeführt werden, um die biologischen Auswirkungen dieser langen Strecke DNA Verbänden aufzuklären. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 ACT-Assay mit ABL-1 Region als Köder DNA in HL-60 Zellen. a. DNA-Strukturure in ABL-1 Region. Die erste Restriktionsenzym in ACT-Assay verwendet wurde Bgl II. Die Primer für die zweite Runde der PCR werden auch durch die Pfeile und die entsprechenden Primer-Nummern gekennzeichnet. b. Gel Muster der ACT-Test in 5% Harnstoff-PAGE. Primerpaar 4626/2961 zur Verstärkung Klon ABL-M1 in der nested PCR verwendet wurde, wurde 4630/2961 für Klon ABL-M2 verwendet, und 4636/2961 war für Klon ABL-M3 verwendet. c. DNA-Sequenz von Klon ABL-M1. DNA-Fragment aus ABL-1 Köder DNA ist rot markiert, und die damit verbundene DNA-Partner ist in den Farben Cyan bezeichnet. Bgl II-Stelle (AGACTC) wurde in grün markiert, und Msp I-Stelle (CCGG) ist in lila markiert. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 PCR-Zyklen beeinflussen ACT Testergebnisse. Mit dem Imprinting Kontrollregion (ICR) in der Igf2/H19 locus als Köder DNA in Maus-Fibroblasten-Zellen wurden verschiedene Rad-Programme in der ersten und zweiten Runde der PCR in der ACT-Test angewendet. 18-20 Zyklen in der ersten Runde der PCR nicht verstärken genug Signal visualisiert werden. Fünfundzwanzig Zyklen in der zweiten PCR-Ergebnisse in deutliche Banden, bei gleichzeitiger Erhöhung der Anzahl der Zyklen für die zweite Runde der PCR induzierte ein Abstrich Muster neben mehr Bands. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Nachweis von Unterschieden in der nuklearen Architektur zwischen normalen Kolon-und Darmkrebs Gewebe in ACT-Test. A. DNA-Struktur des ICR Region IGF2/H19 Locus und IGF2 Gen. Dpn II Standorte für ACT-Assay sind beschriftet. Primer in der zweiten Runde der PCR verwendet werden durch Pfeile und Zahlen in verschiedenen Farben, die auf jeder Bahn in Panel b der Figur entsprechen gekennzeichnet. b. Gel Muster der ACT-Test in 5% Harnstoff-PAGE. Normale Dickdarmgewebe MAD03-1423-und Darmkrebs Gewebe MAD04-149 wurde von Cooperative Human Tissue Network (CHTN) Western Division erhalten. Nach jedem Doppelpunkt Gewebe wurde homogenisiert, war ACT-Test nach dem hier beschriebenen Verfahren durchgeführt. Spur 1 stellt die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961and # 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &#39;) in pink in Panel ein markiertes, Spur 2 stellt die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961 und # 4163 (5&#39;-gccgcgcggccacttccgattcc-3 &#39;) in orange in Panel ein markiertes, Spur 3 zeigt die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961 und # 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3&#39;) in blau in Panel ein markiertes, Spur 4 ist die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961 und # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &#39;) in grün in Panel a. beschriftet Einzigartige Bands, die nur in normalen Kolon sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet sind, und jenen Bands, die nur in Darmkrebsgewebe erschienen sind in roten Pfeilen gekennzeichnet. ICR, Imprinting Kontrollregion; DMR, verschiedene methylierte Region.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

Dekker et al. Entwickelte das Chromosom Konformation erfassen Ansatzes (3C), um die Häufigkeit der Interaktion zwischen zwei genomischen Loci 1 zu erfassen, und 3C wurde ausgiebig auf intra-chromosomale und inter-chromosomal Assoziationen zwischen zwei bekannten DNA-Regionen in Säugetier-Zellen 2 zu untersuchen verwendet -9. Obwohl neu entwickelten Hallo-C Methodik zur Untersuchung der genomweiten DNA Verein aufgebracht werden können, ist ACT-Test noch eine effektive Technik zur Untersuchung von Locus-spezifischen DNA-Interaktion 10-11. Wir haben diesen Ansatz modifiziert werden, um unbekannte DNA Regionen, die mit einer bekannten DNA-Region in kultivierten Maus und humanen Zellen (Abbildung 1) verbunden sind, zu identifizieren. Wir nannten diese Methode der damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay, da es uns eine verlässliche und reproduzierbare Methode, um neue unbekannte DNA-Partnern, die mit einem bekannten Ziel-DNA Bereich 12 Mitarbeiter zu identifizieren. Eine erfolgreiche 3C-Assay mit geeigneten Kontrollen wird vor der Ausführung der neuartigen Aspekte der ACT-Test 13 durchgeführt. Um möglichst viele zugehörige DNA-Regionen wie möglich tofind, ist es notwendig, verschiedene Kombinationen der ersten und zweiten Restriktionsenzyme verwenden. Es ist besonders wichtig, Restriktionsenzyme, die unempfindlich gegen CpG-Methylierung auf den ersten 3C Ligationsschritt durchführen verwenden. Protein-Bindung und DNA-Methylierung können auch Einfluss Restriktionsenzymverdau Effizienz und kann zum Ausfall der Ligation der damit verbundenen DNA-Bereiche für bestimmte Restriktionsenzym Aufschlüsse führen. Das Auftreten von intra-oder inter-chromosomal Ligation ist abhängig von Protein-DNA-Vernetzung und entsprechende physische Karten von beiden der zugehörigen DNA-Regionen. So sind einige Vorversuche notwendig, um eine praktikable wirksame Formaldehyd-Konzentration und Behandlungsdauer in der ACT-Tests erstellen. Eine Reihe von Endkonzentrationen von Formaldehyd (from1.5% bis 2%) wurden in mehreren Labors wurde während der 3C Teil des Tests 7,9 verwendet. Alternativ können die Oligonukleotide als Linker verwendet entworfen, um den Zusammenhalt Ende durch den zweiten Restriktionsenzym geschnitten angepasst werden. Obwohl wir festgestellt, dass 18-20 Zyklen in der ersten Runde der PCR und 20-25 Zyklen in der zweiten Runde der PCR konnten deutliche Banden liefern, ist es notwendig, die beste PCR-Bedingungen für jedes Experiment (Abbildung 2) zu etablieren. Intra-Molekül Glühen zwischen 5&#39;-Ende und 3&#39;-Ende komplementär Adapter Sequenz eines DNA-Stranges kann in PCR auftreten, hemmt es Adapter-spezifischen Primer mit den DNA-Molekül, und führte zu viel niedrigeren Amplifikationseffizienz in der ersten mehreren Zyklen. Nachdem die Ziel-DNA für die Zyklen amplifiziert wurde, kann ihre Höhe sehr viel größer sein als diese unspezifischen Reaktionen und kann der Konkurrenz der Primer an die Target-DNA-Moleküle zu erleichtern. Dies gilt auch, warum wir Hintergrundamplifikation sehen kann, und warum die erste Runde PCR-Produkt muss verdünnt Hintergrund amplification.It zu verringern ist wichtig, um überschüssige Primer aus der PCR-Reaktion zu entfernen, um den Hintergrund in die zweite Runde der PCR verringern. Wie in allen PCR-Experimenten, ist es wichtig, Primer, die nicht in Repeat-Sequenz Regionen, die die Mehrheit der Menschen und der Maus DNA bilden befinden Design. Obwohl neu entwickelten Hallo-C Methodik zur Untersuchung der genomweiten DNA Verein aufgebracht werden können, ist ACT-Test noch eine effektive Technik zur Untersuchung von Locus-spezifischen DNA-Interaktion.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

Genetische Informationen, die von DNA codiert wird, in einer komplexen und stark regulierten Chromatin-Struktur organisiert. Jedes Chromosom befindet sich in einem bestimmten Gebiet, die nach Stadium der Entwicklung oder Zellzyklus ändern kann. Genexpression kann in spezialisierten transkriptionelle Fabriken dort auftreten, wo Chromatin Segmente Schleife aus verschiedenen Chromosomen Territorien, die zu Co-Lokalisation von DNA-Segmenten, die auf unterschiedlichen Chromosomen oder weit voneinander entfernt auf demselben Chromosom vorhanden sein können. The Associated Chromosome Trap (ACT)-Assay bietet eine effektive Methode, um diese Langstrecken-DNA Verbände in einem unvoreingenommenen Weise durch die Erweiterung und Änderung des Chromosoms Konformation Capture-Technik zu identifizieren. Der ACT-Test macht es uns möglich, Mechanismen der Regulation der Transkription in trans zu untersuchen, und können bei der Erläuterung der Beziehung der nuklearen Architektur, die Genexpression in der normalen Physiologie und während Krankheitszuständen.

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Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Die damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay ist ein neuartiges unvoreingenommene Verfahren zur Identifizierung von Langstrecken-DNA-Wechselwirkungen. Die Charakterisierung der Long Range DNA-Wechselwirkungen wird es uns ermöglichen, die Beziehung der nuklearen Architektur, um die Genexpression zu bestimmen, sowohl die normale Physiologie und in krankhaften Zuständen.

Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Forschung

Biologie

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...