Name: associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00
Duration: 14 min 49 s
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我々は彼らの3Cプロトコルを共有するために非常にアデルMurellとウルフライクに感謝。この作品は、国防総省と復員軍人援護局の調査サービスによってサポートされていました。

1。長距離クロマチンの相互作用のホルムアルデヒド固定<ol><li>インキュベーターで15％FBSおよび80〜90％コンフルエントに1 ×ペニシリン/ストレプトマイシンと培養ヒト細胞株RPMI1640培地でHL - 60は37℃、5％CO 2に付属℃に</li><li> 15分間1200 rpmで50 mlのヌンクチューブ、遠心中に細胞を回収し、吸引により培地を除去</li><li>細胞ペレットを再懸濁させる培地5 mlを加えて、血球計算盤を用いて細胞を数える。 RPMI1640 / 10％FBSを有する40mlの容積に約1 × 10 7細胞を利用し、希釈クロマチンを修正するために37％ホルムアルデヒド1.7mlを加える。 </li><li>穏やかに振盪しながら室温で10分間インキュベートし、2Mグリシンの2.4 mlを癒やす。 4時1200 rpmで15分間、遠心° C、そして上清を取り除く。 40ミリリットルの氷冷PBSで1回ペレットを洗浄し、ペレットをスピンダウンし、PBSを取り除く。 </li></ol> 2。核を分離するために細胞溶解<ol><li>新鮮な追加プロテアーゼ阻害剤（1:500希釈）と0.1mMのPMSFと氷冷溶解バッファー（10mMのトリス- HCl、pH8.0、10mMのNaClを、0.2％NP - 40）40ml中の再懸細胞。 90分、15分間2,500 rpmで遠心分離の回転と寒い部屋でインキュベートし、上清を取り除く。 </li></ol> 3。 Bgl IIで制限酵素消化<ol><li> 1 × NEBバッファ3の0.5mlに核を再懸濁し、15μlof10％SDSを加える。振盪しながら1時間、37℃でインキュベートし、その後、トリトンX - 100 SDSを隔離するために20％の45μlを加える。 ℃で1時間振とうしながら37℃でインキュベートする。 </li><li>制限酵素消化のための1 × 10 6細胞核（約15μgの、元の細胞の10分の1）のアリコートを使用してください。ステップ3.1から核のソリューションの55μlを取り出し、1 × NEBバッファ3 および Bgl II（50U/ul）の12μlの433μlを500μlのために作る。 37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 4。相互作用するDNAセグメントのライゲーション<ol><li> 65で加熱することにより95 10％SDSの添加、および変性を追加することにより、制限酵素を失活℃の水浴で20分間。 </li><li> 1 ×ライゲーション緩衝液（30mMのトリス- HCl、pH 8.0、10mMのMgCl 2、10mMのDTT、1mMのATP）と20％のTriton X - 100の360μlを7 mlを加え、1時間37℃でインキュベート。 </li><li> 16 ° Cおよび400 U /μlのT4 DNAリガーゼを50μlを追加して温度を下げる。室温で30分間後、4時間16℃でサンプルをインキュベートし。 </li></ol> 5。 DNA精製<ol><li>プロテイナーゼK300μgのを追加し、65℃で一晩。 </li><li> 37とインキュベート℃で30分間、RNaseの5μgを追加する</li><li>イソプロパノールのフェノール/クロロホルム抽出、及び沈殿物のDNAでDNAを精製する。滅菌蒸留水150μlのDNAを溶解する。 </li></ol> 6。 MSP Iによる消化およびオリゴヌクレオチドリンカーとライゲーション<ol><li> 4〜6時間で37 MSP私の5単位で° CのDNAを精製したの2μgをインキュベートする。 65歳で私をMSP℃で10分間を不活性化し、5 mg / mlのグリコーゲンを1μlとエタノールでDNAを沈殿させる。滅菌蒸留水50μlにDNAペレットを溶解する。 </li><li> 20μMのリンカーオリゴヌクレオチドのL（5&#39; - gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac - 3&#39;）を2μl、20μMのオリゴヌクレオチドS（5&#39; - cggtgaatc - 3を1μl&quot;）、1μlのとMSP I処理したDNAを50μlを混合滅菌蒸留水と10 × T4 DNAリガーゼバッファーの6μlの。液体ワックスとの混合物をカバーしています。 </li><li> 50変性オリゴヌクレオチド℃で1分間Cとサーマルサイクラーで° C 0.5 ° C /分の勾配を10に徐々に冷却します。 </li><li> 400 U /μlのT4 DNAリガーゼ1μlを加え、15℃で一晩インキュベートする。 QIAクイックPCR精製キットを使用してリンカーライゲーションされたDNAを精製し、滅菌蒸留水50μlで溶出。 </li></ol> 7。 PCR増幅と配列分析<ol><li>あなたが長距離相互作用（すなわち、&quot;餌&quot;）のために検査したいDNAの特定の領域のプライマーを選択してください。この例では、我々は、ABL - 1を使用してください。 </li><li>最初のラウンドのPCRは、20μMABL -1特異的プライマー＃4656（5&#39; - gttcaagcgattctcctgcctcga - 3&#39;）、20μMのリンカー特異的プライマー＃2963（5&#39; - 1μlの1μlを使用してを実行するために精製したDNA 1μlを取るgctgaccctgaattcgcacgtgcct - 3&#39;）、3 × Klen Taq DNAポリメラーゼIカクテルと滅菌蒸留水を3μlの3μl。 32 P - dCTPの二つμlのPCR増幅の前に私はカクテル3 × Klen Taq DNAポリメラーゼの100μlに添加される。ホットスタートPCRは2分間、95℃CFOR 2分間72℃であるため、熱サイクル、95の18サイクルで20秒間、65℃40秒C、1分間72℃で、最終的な拡張72 ° Cで行われ5分間。 </li><li>滅菌蒸留水30μlにQIAクイックPCR精製キット、溶出したDNAを用いて最初のラウンドのPCR産物を精製する。 </li><li> 20μMのABL - 1特異的プライマー＃4626（5&#39; - ggagaatttttatctgcctctgtga - 3&#39;）（図1a）、1μlの1μLを加えることによって入れ子プライマーを用いたPCRの第2ラウンドを行うために100 ×希釈した最初のPCR産物を1μlを取るリンカー特異的プライマー＃2961（5&#39; - gtcgttagcggacacagggcgattc - 3&#39;）、滅菌蒸留水の添加3 × Klen Taq DNAポリメラーゼ私はカクテルと3の3μlの20μMの。サーマルサイクリングのスケジュールは、20秒、95℃、67℃40秒、72で拡張子が続く1分、℃で5分間72℃での25サイクルです。 </li><li> 5パーセント尿素- PAGEゲルを実行するとPhosphoImager（図1b）にさらさ画面を走査することによりPCR産物を可視化する。それぞれのPCRバンドを滅菌蒸留水60μlを含むエッペンドルフチュー​​ブにゲル片を溶解し、℃で5分間95℃インキュベートすることにより、ゲルからリサイクルすることができます。すべてのサンプルを収集するために10秒間、10,000 rpmで短時間遠心します。上記と同じ条件を使用して、プライマー対4626分の2961でPCRを実行するためにDNAの鋳型として使用する場合、1μlを取り外します。配列解析をQIAquick PCR精製キットを用いて精製した後に実行することができます。 </li><li> http://genome.ucsc.edu（図1c）：DNA配列は、ウェブサイトでそれらの染色体位置を決定するオンラインツールを用いて分析している。 DNA配列を貼り付けることができる新しいウィンドウを入力して&quot;​​BLAT&quot;をクリックして、新しいウィンドウが&#39;submit&#39;をクリックした後に表示され、&quot;BLATの検索結果を&quot;示しています。 DNA配列の位置を示すために次のウィンドウに入力する100％の同一性で大ヒットの&quot;ブラウザ&quot;をクリック。 </li></ol> 8。代表的な結果 1。その長い範囲のDNAの相互作用を決定するために餌としてABL - 1の領域を使用してACTアッセイ図1a、二つの BglII部位一BamHIでサイトに示すように、ACTアッセイのために選ばれた。 PCRの第2ラウンドでは、プライマーは、2961分の4626は、ABL - M1を増幅するために使用されたセット、2961分の4630は、ABL - M2に使用され、2961分の4636は、ABL - M3のために使用されていました。典型的なゲルのパターンはいくつかのバンド（図1b）への1つを示しています。 ACTアッセイの各フラグメントは、2つの結合されたDNAセグメントで構成されています：第2セグメントは第一の制限酵素認識配列によって餌域セグメントに結合された関連するパートナー、から来る間、一つのセグメントは、餌のDNA領域から導出されます。第二の酵素の認識配列は、関連付けられているパートナーのシーケンス（図1c）の最後に表示されます。クローン化されたABL - M1フラグメントは+133,592,306-133,592,399から染色体9q32.4に位置するABL1の領域からのDNAが含まれており、関連するパートナーは+71,869,882-71,870,107から染色体3p13に位置しています。関連するパートナーのアイデンティティがUCSCゲノムブラウザ（2009年2月にリリースさGRCh7/hg19）を使用して、それらの配列をブラストによって発見されています。PROK2は chr3p13座での関連するパートナーとして同定された。 クローンABL - M3は、ABL - 1遺伝子座に近い内染色協会として同定された一方同様に、ABL - M2関連したパートナーは、chr5q21.1に局在していた。 2。 ACTアッセイを用いて有病率の低下長距離相互作用の決定 3Cに基づいて他のアッセイは、我々は図1に及びIGF2 / H19座12で示されているよりも多くの相互作用のパートナーを報告している。我々が概説されていることを方法論は、最も一般的な長距離相互作用を選択します。しかし、PCRのサイクル数を増やすことによって、それがよく（図2）に応じて追加、それほど頻繁にアソシエーションを識別することが可能です。 3。正常組織に比べ癌細胞における長距離相互作用の違い。 ACTアッセイはまた、核の構造と正常細胞とがん細胞（図3）との間の長距離相互作用の違いを識別するために使用することができます。これらの違いは、細胞形質転換時に発生する核のアーキテクチャの変更を反映することができるため、このアッセイは、最終的には診断目的のために適用可能である。正常および癌組織の両方で発生する同様のゲルパターンは、ACTアッセイの信頼性と再現性であることが示された。 ACTアッセイは、長い範囲のDNAのパートナーを識別できますが、そのようなフィッシュ＆チップスアッセイなどのさらなる分析は、、遠い遺伝子座の間に同定されたアソシエーションの存在を確認する必要があります。遺伝学的、生理学的および生化学的研究は、これらの長い範囲のDNA協会の生物学的影響を解明するために実行することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="図1" /> HL - 60細胞での餌のDNAとして、ABL - 1領域を用いて図1のACTアッセイ 。 A. DNA構造体ABL - 1領域のURE。 ACTアッセイで使用されている最初の制限酵素はBglIIでいました。 PCRの第2ラウンドのためのプライマーも矢印と対応するプライマーの番号によってラベル付けされます。 B. 5パーセント尿素- PAGEにおけるACTアッセイのゲルパターン。プライマーペア4626/2961は、ネステッドPCRでABL - M1クローンを増幅するために使用され、2961分の4630は、クローンABL - M2に使用され、2961分の4636は、クローンABL - M3のために使用されていました。 C.クローンABL - M1のDNA配列。 ABL - 1餌のDNAからDNA断片が赤でラベル付けされている、と関連付けられているDNAのパートナーがシアンでラベル付けされている。 をBgl IIサイト（AGACTC）緑色に標識された、とMSP私のサイトは（CCGG）紫色のラベルが貼られています。 <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="図2" /> 図2のPCRサイクルは、ACTアッセイの結果に影響を与える。マウス線維芽細胞における餌のDNAとしてIgf2/H19座でインプリンティング制御領域（ICR）を使用して、別のサイクリングプログラムはACTアッセイのPCRの第1,2ラウンドに分けて適用されていました。 PCRの最初のラウンドで18から20サイクルは、可視化するのに十分な信号を増幅していませんでした。明確なバンドの第二のPCRの結果で二十5サイクル、PCRの第2ラウンドのためにサイクル数を増やしながら、よりバンドに加えて、スミアのパターンを誘導した。 <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="図3" /> ACTアッセイの正常な結腸組織と結腸癌組織間の核アーキテクチャの違いを図3検出。A. ACTアッセイのためのDNA IGF2/H19軌跡とIGF2遺伝子におけるICR領域の構造。DPN II部位が標識されている。第二ラウンドPCRに用いるプライマーは、図のパネルBの各レーンに対応するさまざまな色の矢印と数字でラベルが付いています。 B. 5パーセント尿素- PAGEにおけるACTアッセイのゲルパターン。正常な結腸組織MAD03 - 1423および大腸癌組織MAD04 - 149は協調ヒト組織ネットワーク（CHTN）西部事業部から入手した。各結腸組織をホモジナイズした後、ACTアッセイは、本明細書に記載の手順に従って実施した。レーン1はプライマーペア＃2961andのパネルにピンク色で標識された＃4161を（5&#39; - tctgcgccatcagggcagtgagac - 3&#39;）を用いたPCRの結果を表し、レーン2はプライマーペア＃2961と＃4163（5&#39; - gccgcgcggccacttccgattcc - 3を用いたPCRの結果を表します。 &quot;）パネルで、オレンジ色のラベルが付いて、レーン3は、プライマーペア＃2961と＃5145（5&#39; - gccatgcaggtaggatttgagctg - 3を用いたPCRの結果を表します&quot;パネルに青色でラベルされた）、レーン4はプライマーペア＃2961を用いたPCRの結果を表します。パネルaに緑で標識されたと＃5151（5&#39; - gtctcaaataggggccagctagcttgg - 3&#39;）正常な結腸組織にのみ現れるユニークなバンドは黄色の矢印で表示されています、と大腸癌組織にのみ登場したそれらのバンドは赤色の矢印で表示されています。 ICR、刷り込み制御領域、DMR、異なるメチル化領域。

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

デッカーら二つのゲノム遺伝子座1の間の相互作用の頻度を検出するために染色体のコンフォメーションキャプチャ（3C）のアプローチを開発し、3Cは、哺乳類細胞内の2つの既知のDNA領域2間のイントラ染色体と間染色体の関連を調査するために広く用いられている-9。新開発のHi - Cの方法論は、ゲノムワイドなDNA関連の研究に適用することができますが、ACTアッセイは、まだ遺伝子座特異的DNA相互作用10-11の研究のための有効な手法です。我々は、培養マウスとヒトの細胞（図1）の既知のDNA領域に関連付けられている未知のDNA領域を識別するために、このアプローチを変更しました。それは私たちに知られている標的DNA領域12に関連付ける新規の未知のDNAのパートナーを識別するために、信頼性と再現性のある方法を提供するように我々は、関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、このメソッドの名前。適切なコントロールを備えた成功3Cアッセイは、ACTアッセイ13の小説の側面を実行する前に実行されます。できるだけ多くの関連するDNA領域としてtofindためには、それは第1および第2の制限酵素の様々な組み合わせを使用する必要があります。それは、最初の3Cライゲーションのステップを実行するためのCpGメチル化へと小文字を区別しない制限酵素を使用することが特に重要です。タンパク質の結合とDNAメチル化はまた、制限酵素消化の効率に影響を与えることができますし、特定の制限酵素消化のために関連するDNA領域のライゲーションの失敗につながることができます。イントラまたはインター染色ライゲーションの発生は、タンパク質- DNA架橋と関連するDNA領域の両方の適切な物理的な地図に依存する。このように、いくつかの予備実験では、ACTアッセイで実用的な効果的なホルムアルデヒドの濃度と処理時間を確立するために不可欠です。ホルムアルデヒド（from1.5％〜2％）の最終濃度の範囲は、アッセイ7,9の3C部分の間にいくつかのラボで使用されている。また、リンカーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、2番目の制限酵素によって切断付着末端と一致するように設計することができます。我々はPCRの第2ラウンドのPCR 20〜25サイクルの最初のラウンドで18から20サイクルが明確なバンドを提供することができることがわかったが、それはそれぞれの実験（図2）のための最高のPCR条件を確立することが必要です。イントラ分子DNA鎖はPCRで発生する可能性の5&#39;末端および3&#39;末端の相補アダプター配列の間のアニーリング、それは、DNA分子とのアニーリングアダプター特異的プライマーを阻害し、最初の数サイクルではるかに低い増幅効率が得られた。ターゲットDNAがサイクルで増幅した後、その量は、これらの非特異的反応よりもはるかに大きくなる可能性、およびターゲットDNA分子にアニーリングプライマーの競争を促進するかもしれない。これは、我々はバックグラウンドの増幅が表示されることがあります理由もあり、なぜ最初のラウンドのPCR産物は、バックグラウンドのamplification.Itを減少させるために希釈する必要があると、PCRの第2ラウンドでバックグラウンドを減少させるためにPCR反応からの過剰なプライマーを除去することが重要です。すべてのPCRベースの実験のように、それはヒトとマウスのDNAの大部分を構成する反復配列領域に位置されていないプライマーを設計することが不可欠です。新開発のHi - Cの方法論は、ゲノムワイドなDNA関連の研究に適用することができますが、ACTアッセイは、まだ遺伝子座特異的DNA相互作用の研究のための有効な手法です。

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

DNAによりコードされる遺伝情報は、複雑かつ高度に規制クロマチン構造に編成されています。各染色体は、開発や細胞周期の段階に応じて変更される可能性がある特定の地域を、占めている。遺伝子発現は、同じ染色体上に離れて別の染色体上に存在するかことができるDNAセグメントの共局在につながるクロマチンのセグメントは、様々な染色体の地域からループアウトすることが、専門的な転写工場で発生することができます。関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、染色体のコンフォメーションキャプチャ技術を拡張し、変更することで、公平な方法でこれらの長期的なDNAの関連付けを識別するための効果的な方法論を提供します。 ACTのアッセイは、私たちはトランスの転写調節のメカニズムを調査することが可能になります、そして通常の生理機能および疾患状態における遺伝子発現への核のアーキテクチャの関係を説明するのに役立ちます。

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Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、長距離DNA相互作用を同定するための新たな方法です。長い範囲のDNAの相互作用の特徴付けは、私たちは両方の通常の生理機能と疾患状態における遺伝子発現への核アーキテクチャの関係を判別することができます。

ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

生物学

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...