Name: associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions at JoVE.com

Nós graças Adelle Murell e Wolf Reik muito para compartilhar seu protocolo 3C. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa eo Serviço de Pesquisa do Departamento de Assuntos de Veteranos.

1. Fixação em formol de interações de longo alcance cromatina <ol><li> Cultura linha celular humana HL-60 em RPMI1640 média com 15% FBS e 1 x penicilina / estreptomicina a confluência de 80-90% em uma incubadora fornecido com 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Coletar as células em um tubo de 50 ml Nunc, centrifugar a 1.200 rpm por 15 minutos e remova o meio por aspiração </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura para voltar a suspender as pelotas de células, e contar as células usando um hemocitômetro. Demorar cerca de 1 x 10 7 células para um volume de 40 ml com FBS RPMI1640 / 10%, em seguida, adicionar 1,7 ml de formaldeído 37% para corrigir a cromatina diluído. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos, agitando suavemente, e depois apagar com 2,4 ml de glicina 2M. Centrifugar por 15 minutos a 1.200 rpm a 4 ° C, e remover o sobrenadante. Lave o pellet uma vez com 40 ml de gelo frio PBS, em seguida, girar o pellet e remover o PBS. </li></ol> 2. Lise celular para isolar núcleos <ol><li> Ressuspender as células em 40 ml de gelo tampão de lise gelada (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) com inibidores da protease recém adicionado (1:500 diluição) e 0,1 mM PMSF. Incubar em uma sala fria, com rotação de 90 minutos, centrifugar a 2.500 rpm por 15 minutos, e remover o sobrenadante. </li></ol> 3. Digestão com enzima de restrição Bgl II <ol><li> Ressuspender os núcleos em 0,5 ml de tampão NEB 1 x 3, e adicionar 15 μlof SDS 10%. Incubar a 37 ° C por 1 hora com agitação, em seguida, adicione 45 mL de 20% Triton X-100 para seqüestrar o SDS. Incubar a 37 ° C por 1 hora com agitação. </li><li> Use uma alíquota de 1 x 10 6 núcleos (cerca de 15 mg, 1 / 10 das células original) para a digestão enzima de restrição. Retire 55 ml de solução núcleos da Etapa 3.1 e completar a 500 mL com 433 mL de um tampão NEB x 3 e 12 mL de Bgl II (50U/ul). Incubar a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Ligadura de segmentos de DNA interagindo <ol><li> Inativar a enzima de restrição, adicionando 95 mL de SDS 10%, e desnaturados por aquecimento a 65 ° C por 20 minutos em banho-maria. </li><li> Adicionar 7 ml de um tampão ligadura x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) e 360 de mL Triton 20% X-100 e incubar a 37 ° C por 1 hora . </li><li> Abaixe a temperatura para 16 ° C e adicionar 50 ul de 400 U / mL DNA ligase T4. Incubar a amostra a 16 ° C por 4 horas e, em seguida, em temperatura ambiente por 30 minutos. </li></ol> 5. Purificação de DNA <ol><li> Adicionar 300 mg de proteinase K, e incubar a 65 ° C durante a noite. </li><li> Adicionar 5 mg de RNase A e incubar a 37 ° C por 30 minutos </li><li> Purificar DNA por extração de fenol / clorofórmio, eo DNA precipitado em isopropanol. Dissolver o DNA em 150 mL de água destilada estéril. </li></ol> 6. Digestão com Msp I e ligadura com linkers oligonucleotídeo <ol><li> Incubar 2μg de DNA purificado com 5 unidades de Msp I, a 37 ° C por 4-6 horas. Inativar Msp I a 65 ° C por 10 minutos, em seguida, precipitar o DNA em etanol com 1 ml de glicogênio 5 mg / ml. Dissolver o sedimento de DNA em 50 ul de água destilada estéril. </li><li> Mix 50 ul de DNA Msp I-tratados com 2 l de um oligonucleotídeo 20 L M linker (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &#39;), 1 ml de um 20 mM oligonucleotídeo S (5&#39;-cggtgaatc-3&#39;), 1 ml de água destilada estéril e 6 mL de tampão ligase 10 x T4 DNA. Cubra a mistura com cera líquida. </li><li> Oligonucleotides desnaturar a 50 ° C por 1 minuto e deixe arrefecer gradualmente para 10 ° C em um gradiente de 0,5 ° C / minuto em um termociclador. </li><li> Adicionar 1 ml de 400 U / mL DNA ligase T4 e incubar a 15 ° C durante a noite. Purificar o DNA linker-ligado com um kit de purificação QIAquick PCR, e eluir em 50 l de água destilada estéril. </li></ol> 7. PCR amplificação e análise de seqüência de <ol><li> Escolha um primer para a região específica do DNA que você deseja examinar para interações de longo alcance (isto é, a &#39;isca&#39;). Neste exemplo, usamos ABL-1. </li><li> Tomar 1 ml do DNA purificado para realizar a primeira rodada PCR utilizando 1 ml de 20 mM de primer -1 ABL específica # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &#39;), 1 ml de 20 mM de primer específico linker # 2963 (5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &#39;), 3μl de 3 x Klen Taq DNA polimerase I cocktail e 3 l de água destilada estéril. Dois mL de 32 P-dCTP é adicionado 100 ul de 3 x DNA polimerase Taq I Klen cocktail antes da amplificação PCR. O ciclo térmico de um hot start PCR é de 72 ° C por 2 min, 95 ° Cpara 2 minutos, 18 ciclos de 95 ° C por 20 segundos, 65 ° C por 40 segundos e 72 ° C por 1 minuto; extensão da final é realizada a 72 ° Cpor 5 minutos. </li><li> Purificar os primeiros produtos rodada PCR usando um kit de purificação QIAquick PCR e DNA eluída em 30 mL de água destilada estéril. </li><li> Tomar 1 ml de 100 x diluída produto PCR primeiro a realizar uma segunda rodada de PCR usando primers nested adicionando 1 ml de 20 mM ABL-1 primer específico # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &#39;) (Figura 1a), 1 ml de 20 mM de primer específico linker # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &#39;), 3 mL de 3 x Klen Taq DNA polimerase I cocktail e 3 l de água destilada estéril. A programação de ciclos térmicos é de 25 ciclos de 95 ° C por 20 segundos, 67 ° C por 40 segundos e 72 ° C por 1 minuto, seguido por extensão a 72 ° C por 5 minutos. </li><li> Visualize os produtos de PCR, executando a 5% gel uréia-PAGE e digitalização a tela exposta em um PhosphoImager (Figura 1b). Cada banda PCR pode ser reciclado a partir do gel, dissolvendo as tiras de gel em um tubo Eppendorf contendo 60 mL de água destilada estéril e incubar a 95 ° C por 5 minutos. Centrifugar brevemente a 10.000 rpm por 10 segundos para recolher todas as amostras. Retire 1 ml para usar como molde de DNA para realizar PCR com o par de iniciadores 2961/4626 usando as mesmas condições, como descrito acima. Análise da seqüência pode ser realizada depois da purificação usando um kit de purificação QIAquick PCR. </li><li> Seqüências de DNA são analisadas utilizando uma ferramenta online para determinar a sua localização cromossômica no site: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Clique em &#39;BLAT&#39; para introduzir uma nova janela que permite colar uma seqüência de DNA, uma nova janela aparece após clicar em &#39;Enviar&#39;, e mostra o &#39;Resultados da Pesquisa BLAT. Clique em &quot;browser&quot; da batida com 100% de identidade para entrar numa janela ao lado mostra a localização da seqüência de DNA. </li></ol> 8. Resultados representante 1. ACT ensaio usando ABL-1 região como isca para determinar suas interações DNA de longo alcance Como ilustrado na Figura 1a, dois sites Bgl II e um site que eu BAMH foram escolhidos para o ensaio ACT. Na segunda rodada de PCR, primer set 4626/2961 foi usado para amplificar ABL-M1, 4630/2961 foi usado para ABL-M2, e 4636/2961 foi usado para ABL-M3. Um padrão típico mostra um gel de várias bandas (Figura 1b). Cada fragmento de um ensaio ACT consiste em dois segmentos de DNA combinado: um segmento é derivada da região do DNA isca, enquanto o segundo segmento vem do parceiro associado, que se juntou ao segmento região isca pela primeira seqüência de reconhecimento enzima de restrição. A seqüência de reconhecimento segunda enzima irá aparecer no final da seqüência de parceiro associado (Figura 1c). O fragmento clonado ABL-M1 contém DNA da região de ABL1 localizado no cromossomo 9q32.4 de +133,592,306-133,592,399, e os parceiros associados está localizado no cromossomo 3p13 de +71,869,882-71,870,107. As identidades dos parceiros associados são descobertos por jateamento suas seqüências usando o browser genoma UCSC (GRCh7/hg19 lançado em fevereiro de 2009). PROK2 foi identificado como o parceiro associado no locus chr3p13. Da mesma forma, a ABL-M2 parceiro associado foi localizada chr5q21.1, enquanto clone ABL-M3 foi identificado como uma associação intra-cromossômicas perto do lugar-1 ABL. 2. Determinar menos prevalente interações de longo alcance usando ensaio ACT Outros ensaios com base em 3C relataram muitos mais parceiros do que a interação que temos mostrado na Figura 1 e na IGF2 / H19 lugar 12. A metodologia que temos delineado irá selecionar as mais prevalentes interações de longo alcance. No entanto, ao aumentar o número de ciclos de PCR, é possível identificar adicional, associações menos freqüentes, bem como (Figura 2). 3. Diferenças nas interações de longo alcance em células de câncer quando comparados com os tecidos normais. O ensaio ACT também pode ser usado para identificar diferenças na arquitetura nuclear e interações de longo alcance entre células normais e células cancerosas (Figura 3). Estas diferenças podem refletir mudanças arquitetura nuclear que ocorrem durante a transformação celular, e, portanto, este ensaio pode vir a ser aplicáveis ​​para fins de diagnóstico. Os padrões de gel semelhantes que ocorrem em ambos os normais e os tecidos de câncer indicou que o ensaio ACT é confiável e repetível. Enquanto o ensaio ACT pode identificar parceiros de longo alcance DNA, análises adicionais, tais como FISH e ensaios ChIP, são obrigados a verificar a presença das associações identificadas entre loci distantes. Estudos genéticos, fisiológicos e bioquímicos podem então ser realizados para elucidar as implicações biológicas dessas associações DNA de longo alcance. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 usando ensaio ACT ABL-1 DNA região como isca em células HL-60. a. Struct DNAure na ABL-1 região. A enzima de restrição usada pela primeira vez no ACT ensaio foi Bgl II. Os primers para a segunda rodada de PCR também estão marcados por setas e números primário correspondente. b. Gel padrão do ensaio ACT em 5% de uréia-PAGE. O par de iniciadores 4626/2961 foi usado para amplificar clone ABL-M1 na PCR nested, 4630/2961 foi usada para clonar ABL-M2, e 4636/2961 foi usada para clonar ABL-M3. c. Seqüência de DNA do clone ABL-M1. Fragmento de DNA a partir de ABL-1 DNA isca é marcado em vermelho, eo parceiro de DNA associado é rotulado em ciano. Bgl II site (AGACTC) foi marcado em verde, e Msp site que eu (CCGG) é marcado em roxo. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 ciclos de PCR afetar os resultados do ensaio ACT. Usando a região de controle imprinting (ICR) no locus Igf2/H19 como isca DNA em células de fibroblastos de rato, os programas de ciclismo diferentes foram aplicadas no primeiro e segundo turnos da PCR no ensaio ACT. 18-20 ciclos no primeiro turno da PCR não amplificar o sinal suficiente para ser visualizado. Vinte e cinco ciclos nos resultados da segunda PCR em bandas claras, enquanto aumenta o número de ciclos para a segunda rodada de PCR induziu um padrão de manchas, além de bandas mais. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 detecção de diferenças na arquitetura nuclear entre o tecido normal e tecido do cólon câncer de cólon em ensaio ACT. A. Estrutura do DNA da região ICR em IGF2/H19 locus e gene IGF2. Locais DPN II para o ensaio ACT são rotulados. Primers utilizados na PCR segunda rodada estão marcados por setas e números em cores diferentes que correspondem a cada pista no painel b da figura. b. Gel padrão do ensaio ACT em 5% de uréia-PAGE. Tecido do cólon normal, MAD03-1423 e tecido de câncer de cólon MAD04-149 foi obtida a partir da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN) Divisão Ocidental. Depois de cada tecido do cólon foi homogeneizado, ensaio ACT foi realizada seguindo os procedimentos aqui descritos. Faixa 1 representa os resultados da PCR usando primers # # 2961and 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &#39;) marcado em rosa em um painel; lane 2 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 4163 (5&#39;-gccgcgcggccacttccgattcc-3 &#39;) marcado em laranja no painel a; faixa 3 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3&#39;) marcada em azul no painel a; lane 4 representa os resultados da PCR usando primers # 2961 e # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &#39;) marcado em verde no painel de a. Bandas originais que só aparecem no tecido do cólon normal são marcados por setas amarelas, e as bandas que apareceu somente no tecido de câncer de cólon são rotulados de setas vermelhas. ICR, região de controle imprinting; DMR, região metilado diferentes.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dekker et al. Desenvolveu o cromossomo conformação capturar abordagem (3C) para detectar a freqüência de interação entre dois loci genômicos 1 e 3C tem sido amplamente utilizado para investigar associações cromossômicas intra-e inter-cromossômicas entre duas regiões do DNA em células de mamíferos conhecidos dois -9. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA 10-11. Nós modificamos essa abordagem para identificar regiões do DNA desconhecidos que estão associados a uma região do DNA conhecido no rato cultivadas e células humanas (Figura 1). Chamamos este método na armadilha cromossomo associado ensaio (ACT), uma vez que nos forneceu um método confiável e reprodutível para identificar novos parceiros DNA desconhecidos que se associam a uma região conhecida de DNA alvo 12. Um ensaio bem sucedido 3C com controles adequados é feita antes de executar os aspectos novos do ensaio ACT 13. A fim tofind tantas regiões do DNA associado quanto possível, é necessário o uso de várias combinações de enzimas de restrição primeiro e segundo. É especialmente importante o uso de enzimas de restrição que são insensíveis a metilação CpG para realizar a etapa ligadura primeiro 3C. A ligação às proteínas e metilação do DNA também podem influenciar a eficiência restrição de digestão enzimática e pode levar à insuficiência de ligadura das regiões DNA associado para digestões certas enzimas de restrição. A ocorrência de ligadura intra ou inter-cromossômicas depende de proteínas DNA-cross-linking e apropriado mapas físicos de ambos das regiões DNA associado. Assim, alguns experimentos preliminares são essenciais para estabelecer uma possível concentração de formaldeído eficaz e tempo de tratamento no ensaio ACT. A gama de concentrações finais de formaldeído (from1.5% para 2%) têm sido utilizados em diversos laboratórios durante a parte 3C do ensaio 7,9. Alternativamente, os oligonucleotídeos utilizados como linkers pode ser projetado para combinar com o final coesa cortado pela enzima de restrição segundo. Embora descobrimos que 18-20 ciclos na primeira rodada de PCR e 20-25 ciclos no segundo turno da PCR poderia fornecer bandas claras, é necessário estabelecer as melhores condições de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula annealing entre seqüência adaptador 5&#39;-end e 3&#39;-end complementares de uma cadeia de DNA pode ocorrer em PCR, inibe específicas do adaptador primário de recozimento com a molécula de DNA, e resultou em eficiência de amplificação muito mais baixo nos primeiros ciclos diversos. Após o DNA alvo foi ampliado para os ciclos, o montante pode ser muito maior do que estas reações inespecíficas, e pode facilitar a competição de primer annealing para as moléculas de DNA alvo. É também por isso nós podemos ver a amplificação de fundo, e porque o primeiro produto da PCR rodada tem que ser diluído para diminuir amplification.It fundo é importante para remover excesso de primers a partir da reação de PCR, a fim de diminuir a fundo na segunda rodada de PCR. Como em todos os experimentos baseados em PCR, é essencial para projetar primers que não estão localizados em regiões de repetição de seqüência, que constituem a maioria do DNA humano e do rato. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

Informação genética codificada pelo DNA é organizado em uma estrutura complexa e altamente regulamentado cromatina. Cada cromossomo ocupa um território específico, que pode mudar de acordo com o estágio de desenvolvimento ou do ciclo celular. Expressão gênica pode ocorrer em fábricas especializadas em segmentos transcricional da cromatina podem loop out cromossomo a partir de territórios diversos, levando a co-localização de segmentos de DNA que podem existir em cromossomos diferentes ou distantes no mesmo cromossomo. A Associated cromossomo Armadilha ensaio (ACT) fornece uma metodologia eficaz para identificar essas associações de longo alcance DNA de uma maneira imparcial, estendendo e modificando o cromossomo técnica de captura de conformação. O ensaio ACT torna possível para nós para investigar os mecanismos de regulação da transcrição em trans, e podem ajudar a explicar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene na fisiologia normal e durante estados de doença.

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Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

O associado armadilha cromossomo ensaio (ACT) é um novo método imparcial para identificar as interações de longo alcance DNA. A caracterização das interações DNA de longo alcance nos permitirá determinar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene em ambos os fisiologia normal e em estados doente.

Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biologia

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...