Name: associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00
Duration: 14 min 49 s
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Agradecemos a Adelle Murell y Reik Lobo mucho por compartir su protocolo 3C. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa y el Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos.

1. El formaldehído fijación de las interacciones de la cromatina de largo alcance <ol><li> La línea de cultivo de células humanas HL-60 en medio RPMI1640 con FBS al 15% y 1 x penicilina / estreptomicina al 80-90% de confluencia en una incubadora suministra con 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Recoger las células en un tubo de 50 ml Nunc, se centrifuga a 1.200 rpm durante 15 minutos, y luego eliminar el medio por aspiración </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo para volver a suspender los sedimentos celulares, y contar las células utilizando un hemocitómetro. Tome aproximadamente 1 x 10 7 células en un volumen de 40 ml con FBS RPMI1640 / 10%, a continuación, añadir 1,7 ml de formaldehído al 37% para arreglar la cromatina diluido. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave, y luego apagar con 2,4 ml de glicina 2M. Centrifugar durante 15 minutos a 1200 rpm a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento una vez con 40 ml de PBS frío hielo, y luego girar hacia abajo el precipitado y retirar el PBS. </li></ol> 2. Lisis celular para aislar los núcleos <ol><li> Resuspender las células en 40 ml de solución amortiguadora de lisis fría (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) con inhibidores de la proteasa recién añadido (dilución 1:500) y 0,1 mM PMSF. Incubar en una cámara frigorífica con una rotación de 90 minutos, se centrifuga a 2.500 rpm durante 15 minutos, y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 3. Restricción de la digestión enzimática con Bgl II <ol><li> Resuspender los núcleos en 0,5 ml de un tampón NEB x 3, y añadir 15 μlof 10% SDS. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora con agitación, a continuación, añadir 45 l de 20% de Triton X-100 para capturar la SDS. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora con agitación. </li><li> Utilice una alícuota de 1 x 10 6 núcleos (alrededor de 15 mg, una décima parte de las células originales) para la digestión con enzimas de restricción. Saque 55 l de solución de los núcleos de Paso 3.1 y enrasar a 500 ml con 433 l de 1 x tampón NEB 3 y 12 l de Bgl II (50U/ul). Se incuba a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 4. La ligadura de segmentos de ADN que interactúan <ol><li> Inactivar la enzima de restricción mediante la adición de 95 l de 10% SDS, y se desnaturalizan por calor a 65 ° C durante 20 minutos en un baño de agua. </li><li> 7 ml de un tampón de ligación x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, MgCl2 10 mM, 10 mM DTT, 1 mM ATP) y 360 l de 20% de Triton X-100 y se incuba a 37 ° C durante 1 hora . </li><li> Baje la temperatura a 16 ° C y añadir 50 l de 400 U / l de ADN ligasa T4. Incubar la muestra a 16 ° C durante 4 horas y después a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li></ol> 5. Purificación de ADN <ol><li> Añadir 300 mg de proteinasa K, y se incuba a 65 ° C durante la noche. </li><li> Añadir 5 g de RNasa A y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos </li><li> Purificar el ADN por extracción con fenol / cloroformo, y el ADN precipitado con isopropanol. Disolver el ADN en 150 ml de agua destilada estéril. </li></ol> 6. La digestión con Msp I y la ligadura con engarces de oligonucleótidos <ol><li> Incubar 2μg de ADN purificado con 5 unidades de Msp I a 37 ° C durante 4-6 horas. Inactivar Msp I a 65 ° C durante 10 minutos, luego precipitar el ADN en etanol con 1 l de 5 mg / ml de glucógeno. Disolver la pastilla de ADN en 50 l de agua destilada estéril. </li><li> Mezclar 50 l de Msp I tratados con ADN con 2 l de una L 20 M oligonucleótido enlazador (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &#39;), 1 l de un oligonucleótido S 20 M (5&#39;-cggtgaatc-3&#39;), 1 l de agua destilada estéril y 6 l de 10 x tampón T4 ADN ligasa. Cubrir la mezcla con la cera líquida. </li><li> Oligonucleótidos se desnaturalizan a 50 ° C durante 1 minuto y dejar enfriar de forma gradual a 10 ° C en un 0,5 ° C / minuto gradiente en un termociclador. </li><li> Añadir 1 l de 400 U / l de ADN ligasa T4 y se incuba a 15 ° C durante la noche. Purificar el ADN linker-liga con un kit QIAquick PCR Purificación, y eluyen en 50 l de agua destilada estéril. </li></ol> 7. Amplificación por PCR y análisis de secuencias <ol><li> Elija una cartilla de la región específica del ADN que se desea estudiar a larga distancia en las interacciones (es decir, el «cebo»). En este ejemplo, usamos ABL-1. </li><li> Tome 1 l de ADN purificado para llevar a cabo la primera ronda de PCR utilizando un l de 20 M -1 ABL cebadores específicos # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &#39;), 1 l de 20 mM imprimación específica enlazador # 2963 (5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &#39;), 3μl de 3 x Klen polimerasa ADN Taq I cóctel y 3 l de agua destilada estéril. Dos l de 32 P-dCTP se añade a 100 l de 3 x ADN polimerasa Taq I Klen cóctel antes de la amplificación por PCR. El ciclo térmico para un arranque en caliente PCR es de 72 ° C durante 2 min, 95 ° CFOR 2 minutos, 18 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos, 65 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto; la última prórroga se realiza a 72 ° Cdurante 5 minutos. </li><li> Purificar los productos de primera ronda de PCR utilizando un kit QIAquick PCR Purificación, y el ADN se eluyen en 30 l de agua destilada estéril. </li><li> Tome 1 l de 100 x diluida primer producto de PCR para llevar a cabo una segunda ronda de PCR utilizando los cebadores anidados mediante la adición de 1 l de 20 mM ABL-1 cebadores específicos # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &#39;) (Figura 1a), 1 l de 20 M de imprimación específica enlazador # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &#39;), 3 l de 3 x Klen polimerasa ADN Taq I cóctel y 3 l de agua destilada estéril. El calendario de ciclos térmicos es de 25 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos, 67 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto, seguido de la extensión a 72 ° C durante 5 minutos. </li><li> Visualizar los productos de PCR mediante la ejecución de un 5% de urea-PAGE gel y el escaneo de la pantalla expuesta en un PhosphoImager (Figura 1b). Cada banda de PCR pueden ser reciclados a partir del gel mediante la disolución de las bandas de gel en un tubo Eppendorf que contiene 60 l de agua destilada estéril, y la incubación a 95 ° C durante 5 minutos. Centrifugar brevemente a 10.000 rpm durante 10 segundos para recoger todas las muestras. Quitar una l que se utilizará como plantilla de ADN para realizar PCR con el primer par de 2961/4626 con las mismas condiciones como se describió anteriormente. Análisis de la secuencia se puede realizar después de la purificación utilizando un kit QIAquick PCR Purificación. </li><li> Secuencias de ADN se analizó mediante una herramienta en línea para determinar su localización cromosómica en el sitio web: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Haga clic en &quot;Blat&quot; para entrar en una nueva ventana que permite pegar una secuencia de ADN, aparecerá una nueva ventana después de hacer clic en &#39;enviar&#39;, y muestra los &quot;Resultados de la búsqueda Blat. Haga clic en &quot;browser&quot; de la exitosa con 100% de identidad para entrar en una ventana al lado de mostrar la ubicación de la secuencia de ADN. </li></ol> 8. Resultados representante 1. ACT ensayo utilizando ABL-1 región como cebo para determinar sus interacciones a largo rango de ADN Como se ilustra en la Figura 1a, dos sitios de Bgl II y un sitio BamH I fueron elegidos para el ensayo de ACT. En la segunda ronda de PCR, primer conjunto 4626/2961 fue utilizado para amplificar ABL-M1, 4630/2961 se utilizó para ABL-M2, y 4636/2961 se utilizó para ABL-M3. Un patrón típico muestra un gel de varias bandas (Figura 1b). Cada fragmento de un ensayo ACT consta de dos segmentos de ADN que combina: un segmento se deriva de la región de ADN cebo, mientras que el segundo segmento proviene del asociado, que se unió al segmento de la región cebo por la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción primera. La secuencia de la enzima segundo reconocimiento aparecerá al final de la secuencia de los miembros asociados (Figura 1c). El clonado ABL-M1 fragmento contiene ADN de la región de ABL1 localizado en el cromosoma 9q32.4 de +133,592,306-133,592,399, y el miembro asociado, se encuentra en el cromosoma 3p13 de +71,869,882-71,870,107. Las identidades de los miembros asociados son descubiertos por las voladuras de sus secuencias utilizando la UCSC genoma navegador (GRCh7/hg19 lanzado en febrero de 2009). PROK2 fue identificado como el miembro asociado en el locus chr3p13. Del mismo modo, el socio de ABL-M2 asociados se localizó en chr5q21.1, mientras que el clon ABL-M3 fue identificado como una asociación dentro de los cromosomas, cerca de la ABL-1 locus. 2. La determinación de las interacciones de largo alcance usando menos prevalentes ensayo ACT Otros ensayos sobre la base de 3C han reportado muchos más socios que interactúan que hemos mostrado en la Figura 1 y en el Igf2 / H19 lugar 12. La metodología que hemos planteado seleccionará las interacciones más frecuentes de largo alcance. Sin embargo, al aumentar el número de ciclos de PCR, es posible identificar las asociaciones adicionales, menos frecuentes, así (Figura 2). 3. Diferencias en las interacciones de largo alcance en las células del cáncer en comparación con tejidos normales. La prueba ACT también puede ser utilizado para identificar las diferencias en la arquitectura y las interacciones nucleares de largo alcance entre células normales y células cancerosas (Figura 3). Estas diferencias pueden reflejar cambios en la arquitectura nuclear que se producen durante la transformación celular, y por lo tanto este ensayo en última instancia, pueden ser aplicables para fines de diagnóstico. Los patrones de gel similares que ocurren tanto en los tejidos normales y el cáncer se indica que la prueba ACT es confiable y repetible. Mientras que el ensayo ACT puede identificar socios a largo rango de ADN, análisis adicionales, tales como peces y ensayos de chip, están obligados a verificar la presencia de las asociaciones identificadas entre loci lejano. Los estudios genéticos, fisiológicos y bioquímicos se puede llevar a cabo para dilucidar las implicaciones biológicas de estas asociaciones de ADN de largo alcance. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 ACT ensayo utilizando ABL-1 región de ADN cebo en células HL-60. a. ADN estructuraUre en ABL-1 región. La enzima de restricción por primera vez en ACT ensayo se Bgl II. Los primers para la segunda ronda de PCR también se etiquetan mediante flechas y números correspondientes de imprimación. b. Gel patrón de la prueba de ACT en el 5% de urea-PAGE. Primer par de 4626/2961 fue utilizado para amplificar el clon de ABL-M1 en la PCR anidada, 4630/2961 se utilizó para clonar ABL-M2, y 4636/2961 se utilizó para clonar ABL-M3. c. La secuencia de ADN del clon ABL-M1. Fragmento de ADN de ABL-1 ADN cebo está etiquetado en rojo, y el socio de ADN asociado tiene la etiqueta de color cyan. Bgl II sitio (AGACTC) fue marcado en verde, y Msp I sitio (CCGG) está marcado en color púrpura. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 ciclos de PCR afectar los resultados del ACT ensayo. Uso de la región de control de impresión (ICR) en el locus IGF-2/H19 como cebo de ADN en las células de fibroblastos de ratón, diferentes programas de ciclismo se aplicaron en la primera y segunda ronda de PCR en la prueba de ACT. 18-20 ciclos en la primera ronda de PCR no amplificar la señal lo suficiente como para ser visualizado. Veinte y cinco ciclos en el segundo los resultados de PCR en las bandas claras, mientras que el aumento del número de ciclos para la segunda ronda de PCR inducido por un patrón de tinción, además de más bandas. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 La detección de diferencias en la arquitectura nuclear entre el tejido normal del colon y el tejido de cáncer de colon en el ensayo ACT. A. La estructura del ADN de la región ICR en IGF-2/H19 lugar y el gen IGF2. Dpn sitios para el ensayo ACT II son etiquetados. Cebadores utilizados en la segunda ronda de PCR están marcados con flechas y números en diferentes colores que corresponden a cada calle, en el panel B de la figura. b. Gel patrón de la prueba de ACT en el 5% de urea-PAGE. Tejido normal del colon MAD03-1423 y el tejido de cáncer de colon MAD04-149 se obtuvo de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN) División Oeste. Después de cada tejido del colon se homogeneizó, ensayo ACT se llevó a cabo siguiendo los procedimientos descritos en este documento. Carril 1 representa los resultados de PCR con el primer par # 2961and # 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &#39;) marcados en color rosa en un panel, carril 2 representa los resultados de PCR con el primer par # 2961 y # 4163 (5&#39;-gccgcgcggccacttccgattcc-3 &#39;) etiqueta de color naranja en un panel, carril 3 representa los resultados de la PCR con el primer par # 2961 y # 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3&#39;) marcados en azul en el panel de una; carril 4 corresponde a los resultados de PCR con el primer par # 2961 y # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &#39;) marcada en verde en el panel de a. Bandas únicas que aparecen sólo en el tejido normal del colon están marcados por flechas amarillas, y esas bandas que apareció sólo en el tejido de cáncer de colon están etiquetados en las flechas rojas. ICR, el control de impresión de la región, DMR, región metilado diferentes.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

Dekker et al. Desarrolló la conformación de los cromosomas de captura (3C) método para detectar la frecuencia de interacción entre dos loci del genoma 1 y 3C se ha utilizado ampliamente para investigar las asociaciones intra-e inter-cromosómicas cromosómicas entre dos regiones de ADN en células de mamíferos conocidos 2 -9. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus 10-11. Hemos modificado este enfoque para identificar las regiones desconocidas de ADN que están asociados con una región de ADN conocidos en el ratón y células humanas cultivadas (Figura 1). Hemos llamado a este método la trampa cromosómicas asociadas (ACT) de ensayo, ya que nos proporciona un método fiable y reproducible para identificar nuevos socios de ADN desconocido que se asocian con una zona piloto de ADN que se sabe 12. Un ensayo con éxito 3C con los controles adecuados se realiza antes de la ejecución de los aspectos novedosos de la prueba ACT 13. Con el fin de tofind como muchas regiones de ADN asociadas como sea posible, es necesario el uso de varias combinaciones de enzimas de restricción primera y segunda. Es especialmente importante la utilización de enzimas de restricción que son sensibles a la metilación CpG para llevar a cabo el primer paso para la ligadura de 3C. La unión a proteínas y la metilación del ADN también pueden influir en la eficiencia de la enzima de restricción digestión y puede conducir al fracaso de la ligadura de las regiones de ADN asociadas a ciertas digestiones con enzimas de restricción. La aparición de la ligadura de intra o inter-cromosómica depende de la proteína-ADN de entrecruzamiento y apropiado mapas físicos de las dos regiones de ADN asociadas. Por lo tanto, algunos experimentos preliminares son esenciales para establecer una concentración de formaldehído eficaz posible y el tiempo de tratamiento en el ensayo de ACT. Una gama de concentraciones finales de formaldehído (from1.5% a 2%) se han utilizado en varios laboratorios en la parte de 3C de la prueba de 7,9. Por otra parte, los oligonucleótidos utilizados como enlaces pueden ser diseñados para coincidir con el extremo cohesivo cortado por la enzima de restricción segundos. Aunque se encontró que los ciclos de 18-20 en la primera ronda de PCR y los ciclos de 20-25 en la segunda ronda de PCR podría proporcionar bandas claras, es necesario establecer las mejores condiciones de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula recocido entre la secuencia del adaptador extremo 5 &#39;y 3&#39; final complementaria de una cadena de ADN puede ocurrir en la PCR, que inhibe específica del adaptador de primer recocido con la molécula de ADN, y dio lugar a la eficiencia de amplificación mucho menor en el primero de varios ciclos. Después de la meta de ADN fue amplificado por ciclos, su cantidad puede ser mucho mayor que estas reacciones no específicas, y puede facilitar la competencia de primer recocido a las moléculas de ADN diana. Esta es la razón por la que podemos ver a la amplificación de fondo, y por qué el producto la primera ronda de PCR tiene que ser diluida para disminuir amplification.It de fondo es importante para eliminar el exceso de cebadores de la reacción de PCR con el fin de disminuir el fondo en la segunda ronda de PCR. Como en todos los experimentos basados ​​en la PCR, es de vital importancia el diseño de cebadores que no se encuentran en las regiones de secuencia de repetición, que constituyen la mayoría del ADN humano y el ratón. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

La información genética codificada por el ADN está organizado en una estructura de la cromatina complejo y altamente regulado. Cada cromosoma ocupa un territorio específico, que puede variar de acuerdo a la etapa de desarrollo o del ciclo celular. La expresión de genes puede ocurrir en las fábricas especializadas en los segmentos de la transcripción de la cromatina puede salida en lazo de los territorios de varios cromosomas, dando lugar a la co-localización de segmentos de ADN que pueden existir en diferentes cromosomas o muy separados en el mismo cromosoma. La trampa de cromosomas asociados (ACT) de ensayo proporciona una metodología eficaz para identificar el ADN de estas asociaciones a largo plazo de una manera imparcial mediante la ampliación y modificación de la conformación técnica de captura de los cromosomas. La prueba ACT hace posible para nosotros para investigar los mecanismos de regulación transcripcional en trans, y puede ayudar a explicar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión de genes en la fisiología normal y durante estados de enfermedad.

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Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

La trampa de cromosoma asociados (ACT) de ensayo es un nuevo método imparcial para la identificación de largo alcance interacciones ADN. La caracterización de las interacciones de largo alcance de ADN nos permitirá determinar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión génica en la fisiología normal y en estados de enfermedad.

Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Investigación

Biología

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparación de los cromosomas politénicos de Drosophila Calabazas para el Etiquetado de anticuerpos

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...