Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المنهج التجريبي الذي يجمع بين وصفنا في مواقع محددة واثنين من العلامات fluorophore الجهد الكهربائي المشبك للتحقيق في العلاقة بين البنية والوظيفة من بروتينات الغشاء. ويمكن استخدام هذه التقنية للحصول على وقت حلها معلومات عن ديناميات بتكوين جزئي للبروتينات غشاء أثناء النقل الأيوني. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تصمم هذا النهج في العمل مع مختلف البروتينات مثل مضخات ايون ، وقنوات ايون والناقلين. بالإضافة إلى التحقيق في ديناميكية بتكوين جزئي في بقايا محددة ، فمن الممكن أيضا استخدام مضان نقل الطاقة الرنين لتحديد المسافة قيود داخل عميم الإنزيم. يمكن تحديد المسافات بين بقايا فضلا عن قياس الحركة النسبية بين مفارز مساعدة في حل المسائل الرئيسية التي تنطوي على آليات النابضة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> كاشف / معدات </th><th> شركة </th><th> كاشف / معدات </th><th> شركة </th></tr><tr><td> 100W المصدر بالتنغستن الخفيفة </td><td> كارل زايس Microimaging </td><td> فلوريسئين - 5 - maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F - 4 </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> عالية الصرفة كيت استخراج PCR </td><td> روش </td></tr><tr><td> 3،0-4،0 Ethicon Vicryl </td><td> جونسون آند جونسون </td><td> mMessage mMachine كيت </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 الإثارة تصفية </td><td> أوميغا البصرية </td><td> MS - 222 </td><td> سيغما الدريخ </td></tr><tr><td> 505DRLP مزدوج اللون المرآة </td><td> أوميغا البصرية </td><td> Nucleospin كيت البلازميد </td><td> Macherey - ناجل </td></tr><tr><td> Macherey - ناجل </td><td> أوميغا البصرية </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> الحرارية العلمية </td></tr><tr><td> 535DF50 الإثارة تصفية </td><td> أوميغا البصرية </td><td> PC - 10 Micropipette بولير </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP مزدوج اللون المرآة </td><td> أوميغا البصرية </td><td> pCLAMP 10 برامج </td><td> محوار الآلات </td></tr><tr><td> 565ALP الانبعاثات التصفية </td><td> أوميغا البصرية </td><td> PfuTurbo بوليميراز الدنا </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP الانبعاثات التصفية </td><td> أوميغا البصرية </td><td> PIN - 022A الضوئي </td><td> المتحدة للكشف عن تقنيات </td></tr><tr><td> 570DRLP مزدوج اللون المرآة </td><td> أوميغا البصرية </td><td> مرشحات الاستقطاب </td><td> شركة لينوس Phtonics </td></tr><tr><td> شركة لينوس Phtonics </td><td> أوميغا البصرية </td><td> QuickChange الموقع الموجه Mutagenisis كيت </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> محوري مجهر ممتحن الإسفار </td><td> كارل زايس MicroImaging GMBH </td><td> RC - 10 غرفة الإسفار </td><td> نذير الآلات </td></tr><tr><td> نذير الآلات </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> tetramethylrhodamine - 6 - maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata نظام الحصول على البيانات 1440A </td><td> محوار الآلات </td><td> TOP10 خلايا Electrocompetent </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> أنا DPN </td><td> نيو إنجلاند Biolabs </td><td> توربو تك - 05X مكبر للصوت </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

الجهد الكهربائي اثنين المشبك الكهربية (TEVC) هو أداة قوية لتحقيق آلية ايون transport1 لطائفة واسعة من البروتينات الغشاء بما في ذلك قنوات ايون 2 ، 3 مضخات ايون ، والنقل 4. تضافرت التطورات الأخيرة في مواقع محددة إلى جانب العلامات fluorophore TEVC لدراسة ديناميات بالتزامن بتكوين جزئي في وظيفة محددة ، وبقايا من هذه البروتينات على سطح الخلايا واحد. سنقوم بشرح طريقة لدراسة ديناميات بتكوين جزئي للبروتينات غشاء من خلال رصد التغيرات في وقت واحد ومضان الحالي باستخدام الجهد المشبك قياس التألق. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لفحص الحركة الجزيئية للبروتينات غشاء الموقع تحديدا استبدال السيستين التالية وموقع الموجه fluorophore 5،6 الوسم. وعلاوة على ذلك ، وهذه الطريقة توفر نهجا لتحديد المسافة بين بقايا القيود المحددة 7،8. ويتحقق ذلك عن طريق ربط الجهات المانحة بشكل انتقائي ومتقبل لاثنين من مخلفات fluorophores السيستين تحولت من الاهتمام. باختصار ، يتم تنفيذ هذه التجارب التالية التعبير الفنية المطلوبة من البروتين على سطح leavis القيطم البويضات. مساحة كبيرة من هذه البويضات وظيفية تمكن القياسات السطحية وإشارة قوية مضان 5. ومن الممكن أيضا لتغيير الأوضاع بسهولة خارج الخلية مثل يجند ، ودرجة الحموضة أو الكاتيونات / الأنيونات ، والتي يمكن أن توفر مزيدا من المعلومات عن آلية للبروتينات غشاء 4. أخيرا ، مكنت التطورات الأخيرة أيضا للتلاعب من الأيونات الداخلية حدد التالية شاركت في التعبير مع بروتين الثانية 9. يوصف بروتوكول لدينا في أجزاء متعددة. الأولى ، شرع الطفرات السيستين المسح بواسطة اكتمال وضع العلامات على مخلفات fluorophore يقع في واجهة من والمجالات عبر الغشاء خارج الخلية. وتهدف التجارب اللاحقة للتعرف على بقايا التي تبين التغيرات الكبيرة في كثافة مضان (&lt;5 ٪) 3 عند تغيير متعلق بتكوين جزئي من البروتين. الثانية ، وتتم مقارنة هذه التغييرات في كثافة مضان لمعلمات الحركية للبروتين الغشاء من أجل ربط ديناميكية بتكوين جزئي إلى وظيفة البروتين 10. وهذا يتيح إجراء تحليل دقيق للاقتراح البيوفيزيائية الجزيئي للبروتين الهدف. أخيرا ، يمكن أن يكون المسمى two مخلفات عميم الإنزيم مع الجهات المانحة وfluorophore متقبل من أجل تحديد القيود المسافة باستخدام أساليب الأنحلال الضوئي المانحة. ومن الممكن أيضا لرصد الحركة النسبية للمفارز البروتين العلامات التالية مع الجهات المانحة وfluorophore المتقبلة.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

سنقوم بشرح طريقة الذي يقيس حركية النقل ايون للبروتينات غشاء جنبا إلى جنب مع مواقع محددة تحليل التغيرات متعلق بتكوين باستخدام مضان على الخلايا واحد. هذه التقنية هي قابلة للتكيف مع القنوات الأيونية ، ومضخات نقل أيون ويمكن استخدامها لتحديد المسافة بين القيود مفارز البروتين.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

دراسة BCL-2 وظيفة الأسرة مع حويصلات كبيرة Unilamellar

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...