Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

De experimentele aanpak die beschrijven we een combinatie van site-specific fluorofoor etikettering en de twee elektroden spanning klem om de relatie tussen structuur en functie van membraaneiwitten te onderzoeken. Deze techniek kan gebruikt worden om tijdsopgeloste informatie te verkrijgen over de conformationele dynamica van membraaneiwitten tijdens het ionen transport. Bovendien kan deze aanpak worden afgestemd op werken met verschillende eiwitten zoals ion pompen, ionenkanalen en transporteurs. In aanvulling op het onderzoek naar de conformationele dynamiek op een bepaald residu, is het ook mogelijk om de fluorescentie resonantie energie overdracht te gebruiken om op afstand beperkingen binnen een holoenzyme te bepalen. De bepaling van de afstanden tussen de residuen en het meten van de relatieve beweging tussen de subeenheden kan helpen bij het oplossen belangrijke vragen met betrekking tot gating mechanismen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / Equipment </th><th> Vennootschap </th><th> Reagens / Equipment </th><th> Vennootschap </th></tr><tr><td> 100W Tungsten Light Source </td><td> Carl Zeiss microimaging </td><td> fluoresceïne-5-maleïmide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> High-Pure PCR Extraction Kit </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 excitatiefilter </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroic spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> Nucleospin Plasmid Kit </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000C Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 excitatiefilter </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipet Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroic spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> pCLAMP 10 Software </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP emissie-filter </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo DNA Polymerase </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP emissie-filter </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A Fotodiode </td><td> United Technologies Detector </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroic spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> Gepolariseerde filters </td><td> Linos Phtonics Inc </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner fluorescentie microscoop </td><td> Carl Zeiss microimaging GMBH </td><td> RC-10 fluorescentie Kamer </td><td> Warner Instruments </td></tr><tr><td> Warner Instruments </td><td> Life Technologies </td><td> tetramethylrhodamine-6-maleïmide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A data-acquisitiesysteem </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 elektrocompetente Cellen </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> DPN I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X versterker </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Twee electrode spanning klem elektrofysiologie (TEVC) is een krachtig hulpmiddel om het mechanisme van ion transport1 te onderzoeken voor een breed scala van membraaneiwitten waaronder ion kanalen 2, ionenpompen 3, 4 en transporteurs. Recente ontwikkelingen hebben gecombineerd site-specific fluorofoor etikettering naast TEVC gelijktijdig de conformationele dynamiek te onderzoeken op specifieke residuen en de functie van deze eiwitten op het oppervlak van de individuele cellen. We beschrijven een methode om de conformationele dynamica van membraaneiwitten studie door tegelijkertijd de controle fluorescentie en huidige veranderingen met behulp van voltage-clamp fluorometrie. Deze benadering kan worden gebruikt om de moleculaire beweging van membraaneiwitten site-specifiek volgende cysteïne vervanging en site-directed fluorofoor labeling 5,6 onderzoeken. Bovendien is deze methode biedt een aanpak om de afstand tussen specifieke beperkingen residuen 7,8 vast te stellen. Dit wordt bereikt door selectief te bevestigen donor en acceptor fluoroforen om twee gemuteerde cysteïne-residuen van belang. In het kort worden deze experimenten uitgevoerd na de functionele expressie van het gewenste eiwit op het oppervlak van Xenopus Leavis eicellen. Het grote oppervlak van deze eicellen kan gemakkelijke functionele metingen en een robuuste fluorescentie-signaal 5. Het is ook mogelijk om gemakkelijk veranderen de extracellulaire voorwaarden, zoals pH, ligand of kationen / anionen, waar nadere inlichtingen kunnen verschaffen over het mechanisme van membraaneiwitten 4. Tot slot hebben de recente ontwikkelingen het ook mogelijk de manipulatie van geselecteerde interne ionen volgende co-expressie met een tweede eiwit 9. Ons protocol wordt beschreven in meerdere delen. De eerste, cysteine ​​scanning mutagenese voorafgegaan door fluorofoor etikettering is voltooid op de residuen zich op het grensvlak van de transmembraan-en extracellulaire domeinen. Latere experimenten zijn bedoeld om residuen die grote veranderingen in fluorescentie-intensiteit (&lt;5%) 3 aan te tonen op een conformationele verandering van het eiwit te identificeren. Ten tweede zijn deze veranderingen in fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de kinetische parameters van het membraan eiwit om de conformationele dynamiek correleren met de functie van het eiwit 10. Dit maakt een rigoureuze biofysische analyse van de moleculaire beweging van het doelwit eiwit. Ten slotte kan twee residuen van de holoenzyme worden gelabeld met een donor en acceptor fluorofoor om op afstand beperkingen met behulp van donor photodestruction methoden vast te stellen. Het is ook mogelijk om de relatieve beweging van eiwitsubeenheden te controleren na het labelen met een donor en acceptor fluorofoor.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...