Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גישה ניסויית שאנו מתארים המשלב אתר ספציפי תיוג fluorophore ושני מתח האלקטרודה מהדק כדי לחקור את הקשר בין המבנה והתפקוד של חלבונים בממברנה. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להשיג זמן לפתור מידע על הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים בממברנה במהלך ההובלה יון. יתר על כן, גישה זו ניתן להתאים את העבודה עם חלבונים שונים, כגון משאבות יונים, תעלות יונים מובילי. בנוסף חוקרת את הדינמיקה קונפורמציה בבית משקע מסוים, אפשר גם להשתמש להעברת הקרינה אנרגיה בתהודה כדי לקבוע מגבלות מרחק בתוך holoenzyme. קביעת המרחקים בין שאריות כמו גם מדידת התנועה היחסית בין יחידות משנה יכול לעזור לפתור שאלות מפתח מעורבים מנגנונים gating.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מגיב / ציוד </th><th> חברה </th></tr><tr><td> טונגסטן 100W מקור האור </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> והעמסת-5-maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> High-Pure-PCR ערכת חילוץ </td><td> רוש </td></tr><tr><td> 3.0-4.0 Ethicon Vicryl </td><td> ג&#39;ונסון אנד ג&#39;ונסון </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 עירור במסנן </td><td> אומגה אופטי </td><td> MS-222 </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroic במראה </td><td> אומגה אופטי </td><td> Nucleospin פלסמיד Kit </td><td> Macherey-נגל </td></tr><tr><td> Macherey-נגל </td><td> אומגה אופטי </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 עירור במסנן </td><td> אומגה אופטי </td><td> PC-10 micropipette פולר </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroic במראה </td><td> אומגה אופטי </td><td> pCLAMP 10 תוכנה </td><td> אקסון מכשירים </td></tr><tr><td> 565ALP פליטה פילטר </td><td> אומגה אופטי </td><td> PfuTurbo פולימראז ה-DNA </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP פליטה פילטר </td><td> אומגה אופטי </td><td> PIN-022A photodiode </td><td> הברית גלאי טכנולוגיות </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroic במראה </td><td> אומגה אופטי </td><td> מסננים מקוטב </td><td> Linos Phtonics בע&quot;מ </td></tr><tr><td> Linos Phtonics בע&quot;מ </td><td> אומגה אופטי </td><td> QuickChange לאתר בימוי Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio בוחן מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> Carl Zeiss MicroImaging GMBH </td><td> RC-10 Fluorescence הקאמרית </td><td> וורנר מכשירים </td></tr><tr><td> וורנר מכשירים </td><td> החיים טכנולוגיות </td><td> tetramethylrhodamine-6-maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A נתוני מערכת הרכישה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> TOP10 תאים Electrocompetent </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> אני DPN </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X מגבר </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

שני מתח האלקטרודה מהדק electrophysiology (TEVC) הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את המנגנון של יון transport1 עבור מגוון רחב של חלבונים בממברנה כולל תעלות יונים 2, 3 משאבות יונים, מובילי 4. ההתפתחויות האחרונות שילבו אתר ספציפי תיוג fluorophore לצד TEVC במקביל כדי לבחון את הדינמיקה קונפורמציה על שאריות ספציפי והתפקוד של החלבונים האלה על פני השטח של תאים בודדים. נתאר שיטה ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים בממברנה בו זמנית על ידי ניטור השינויים פלואורסצנטי הנוכחי באמצעות מתח-clamp fluorometry. גישה זו ניתן להשתמש כדי לבחון את ההצעה המולקולרי של חלבונים בממברנה אתר ספציפי החלפת ציסטאין הבאים לאתר מכוונת fluorophore תיוג 5,6. יתר על כן, שיטה זו מספקת גישה כדי לקבוע מגבלות המרחק בין שאריות ספציפי 7,8. זו מושגת על ידי צירוף סלקטיבי fluorophores התורם acceptor לשני שאריות ציסטאין מוטציה של עניין. בקיצור, ניסויים אלה מבוצעים בעקבות ביטוי תפקודי של החלבון הרצוי על פני השטח של ביציות Xenopus ליוויס. שטח פנים גדול של ביציות אלה מאפשרת מדידות תפקודית הקליל אות הקרינה החזקה 5. זה ניתן גם בקלות לשנות את התנאים תאיים כגון ליגנד pH, או קטיונים / אניונים, אשר יכול לספק מידע נוסף על מנגנון של חלבונים בממברנה 4. לבסוף, ההתפתחויות האחרונות אפשרו גם מניפולציה של יונים פנימי לבחור הבא שיתוף ביטוי עם חלבון שנייה 9. פרוטוקול שלנו מתואר חלקים מרובים. ראשית, mutagenesis ציסטאין סריקה התחיל על ידי תיוג fluorophore הושלמה ב שאריות ממוקם על הממשק של הטרנסממברני ותחומים תאיים. ניסויים מאוחרים יותר שנועדו לזהות שאריות אשר ממחישות שינויים גדולים בעוצמת הקרינה (&lt;5%) 3 על שינוי קונפורמציה של החלבון. שנית, שינויים אלו הם בעוצמת הקרינה לעומת הפרמטרים הקינטית של חלבון הממברנה על מנת לתאם את הדינמיקה קונפורמציה לפונקציה של החלבון 10. זה מאפשר ניתוח biophysical קפדני של תנועה מולקולרית של חלבון המטרה. לבסוף, שתי שאריות של holoenzyme יכול להיות מתויג עם תורם ו fluorophore acceptor על מנת לקבוע מגבלות מרחק באמצעות שיטות photodestruction התורם. אפשר גם לפקח על התנועה היחסית של יחידות משנה חלבון הבאה תיוג עם תורם ו fluorophore acceptor.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...