Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
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	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々が記述している実験的なアプローチは、構造と膜タンパク質の機能との関係を調査するために、サイト固有の蛍光物質の標識二電極電圧クランプを兼ね備えています。この手法は、イオン輸送中の膜タンパク質の立体構造のダイナミクスを時間分​​解情報を取得するために使用することができます。さらに、このアプローチは、イオンポンプ、イオンチャネルやトランスポーターなどの様々なタンパク質で動作するように調整することができます。 特定の残基に立体構造のダイナミクスを調べるに加えて、それはホロ酵素内での距離の制約を決定するために蛍光共鳴エネルギー移動を使用することも可能です。残基だけでなく、サブユニット間の相対運動を測定する間の距離の決定は、ゲーティング機構に関わる重要な問題を解決することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/機器</th><th>会社</th><th>試薬/機器</th><th>会社</th></tr><tr><td> 100Wタングステン光源</td><td>カールツァイスマイクロイメージング</td><td>フルオレセイン-5 - マレイミド</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td> 1B150F - 4 </td><td>世界の精密機器</td><td>ハイピュアPCR抽出キット</td><td>ロッシュ</td></tr><tr><td> 3.0から4.0エチコンVicryl </td><td>ジョンソン＆ジョンソン</td><td> mMessage mMachineキット</td><td>アンビオン</td></tr><tr><td> 475AF40励起フィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> MS - 222 </td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td> 505DRLPダイクロイックミラー</td><td>オメガオプティカル</td><td> Nucleospinプラスミドキット</td><td>マシュレ-ナーゲル</td></tr><tr><td>マシュレ-ナーゲル</td><td>オメガオプティカル</td><td>光度計2000C Sprectrophotometer </td><td>サーモサイエンティフィック</td></tr><tr><td> 535DF50励起フィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> PC - 10マイクロピペットプラー</td><td>ナリシゲ</td></tr><tr><td> 560DRLPダイクロイックミラー</td><td>オメガオプティカル</td><td> 10ソフトウェアをpCLAMP </td><td>アクソンインスツルメンツ</td></tr><tr><td> 565ALPエミッションフィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> PfuTurbo DNAポリメラーゼ</td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLPエミッションフィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td> PIN - 022Aフォトダイオード</td><td>ユナイテッド検出技術</td></tr><tr><td> 570DRLPダイクロイックミラー</td><td>オメガオプティカル</td><td>偏光フィルター</td><td>リノスPhtonics株式会社</td></tr><tr><td>リノスPhtonics株式会社</td><td>オメガオプティカル</td><td>クイックチェンジサイト - ディレクMutagenisisキット</td><td>ストラタジーン</td></tr><tr><td>アクシオ審査蛍光顕微鏡</td><td>カールツァイスマイクロイメージングGMBH </td><td> RC - 10蛍光商工会議所</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td></tr><tr><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>テトラメチルローダミン- 6 -マレイミド</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td> Digidata 1440Aデータ収集システム</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> TOP10エレクトロコンピテント細胞</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td> DPN私</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>ターボテック- 05Xアンプ</td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

二つの電極電圧クランプ電気生理学（TEVC）は、イオンチャネル2、イオンポンプ3、及びトランスポーター4を含む膜タンパク質の多種多様なイオンtransport1のメカニズムを調査する強力なツールです。最近の動向は、同時に、単一の細胞の表面上の特定の残基およびこれらのタンパク質の機能で、構造動力学を調べるためにTEVCと並んで、サイト固有の蛍光物質のラベリングを組み合わせている。 我々は、同時に電圧クランプ蛍光を用いて蛍光と現在の変更を監視することによって、膜タンパク質の立体構造のダイナミクスを研究する方法を説明します。このアプローチは、膜タンパク質部位特異的に以下のシステインの置換と部位特異的蛍光物質標識5,6の分子運動を調べるために使用することができます。さらに、このメソッドは、特定の残基7,8間の距離の制約を決定するアプローチを提供しています。これは、選択的に関心のある2つの変異システイン残基へのドナーとアクセプターフルオロフォアを取り付けることによって実現されます。 簡単に言えば、これらの実験は、 アフリカツメガエルリービスの卵母細胞の表面上に所望のタンパク質の機能発現に続く実行されます。これらの卵母細胞の大きな表面積は、容易な機能の測定と堅牢な蛍光信号5が可能になります。それは容易に膜タンパク質4のメカニズムに関するさらなる情報を提供することができるようなpHは、リガンドまたはカチオン/アニオンなどの細胞外の条件を、変更することも可能です。最後に、最近の進展はまた、第二のタンパク質9との共発現を以下のセレクト内部イオンの操作を有効にしている。 我々のプロトコルは、複数の部分で説明されています。最初に、スキャン突然変異誘発は蛍光体の標識によって進行システインは、膜貫通及び細胞外ドメインのインタフェースに位置する残基で完了する。その後の実験はタンパク質のコンフォメーション変化によって蛍光強度（&lt;5％）3の大きな変化を示す残基を同定するために設計されています。第二に、蛍光強度の変化は、タンパク質10の機能に構造動力学を関連づけるために、膜タンパク質の動力学的パラメーターと比較されます。これは、標的タンパク質の分子運動の厳密な生物物理学的な分析が可能になります。最後に、ホロ酵素の二つの残基がドナーの光破壊法を用いて距離の制約を決定するために、ドナーとアクセプターの蛍光団で標識することができます。それは、ドナーとアクセプターの蛍光団で標識は、次のタンパク質サブユニットの相対的な動きを監視することも可能です。

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Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

生物学

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

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脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

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高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

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