Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
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	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. 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E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리가 설명하는 실험 방법은 사이트 특정 형광단 라벨 두 전극 전압 막 단백질의 구조와 기능 사이의 관계를 조사 클램프를 결합합니다. 이 기술은 이온 수송 중에 막 단백질의 conformational 역학에서 시간 해결 정보를 얻을 수 있습니다. 또한이 접근 방법은 이러한 이온 펌프, 이온 채널과 전송기 등 다양한 단백질과 함께 작동하도록 맞출 수 있습니다. 특정 잔여물에 conformational 역학을 조사 이외에, 그것은 holoenzyme 거리 내에 제약을 결정하기 위해 형광 공명 에너지 전달을 사용하는 것도 가능합니다. 잔류물뿐만 아니라 subunits 사이의 상대 운동을 측정 사이의 거리의 결정은 게이팅 메커니즘과 관련된 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 </th><th> 회사 </th><th> 시약 / 장비 </th><th> 회사 </th></tr><tr><td> 100W 텅스텐 광원 </td><td> 칼 자이스 혈구 Microimaging </td><td> 플루오레신 - 5 - maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F - 4 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 하이 퓨어 PCR 추출 키트 </td><td> 로체 </td></tr><tr><td> 3.0-4.0 Ethicon Vicryl </td><td> 존슨 &amp; 존슨 </td><td> mMessage mMachine 키트 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> 475AF40 여기 필터 </td><td> 오메가 광학 </td><td> MS - 222 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td></tr><tr><td> 505DRLP 이색성 거울 </td><td> 오메가 광학 </td><td> Nucleospin 플라스미드 키트 </td><td> Macherey - 나겔 </td></tr><tr><td> Macherey - 나겔 </td><td> 오메가 광학 </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> 써모 과학 </td></tr><tr><td> 535DF50 여기 필터 </td><td> 오메가 광학 </td><td> PC - 10 Micropipette 풀러 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP 이색성 거울 </td><td> 오메가 광학 </td><td> 10 소프트웨어를 pCLAMP </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td></tr><tr><td> 565ALP 방출 필터 </td><td> 오메가 광학 </td><td> PfuTurbo DNA 중합 효소 </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP 방출 필터 </td><td> 오메가 광학 </td><td> PIN - 022A Photodiode </td><td> 미국 감지기 기술 </td></tr><tr><td> 570DRLP 이색성 거울 </td><td> 오메가 광학 </td><td> 편광 필터 </td><td> Linos Phtonics 주식 회사 </td></tr><tr><td> Linos Phtonics 주식 회사 </td><td> 오메가 광학 </td><td> QuickChange 사이트 감독 Mutagenisis 키트 </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio 이그 형광 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 MicroImaging GMBH </td><td> RC - 10 형광 회의소 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td></tr><tr><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 생활 기술 </td><td> tetramethylrhodamine - 6 - maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A 데이터 수집 시스템 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> TOP10 Electrocompetent 셀 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Dpn I </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> 터보 테크 - 05X 증폭기 </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

두 전극 전압 클램프 전기 생리학 (TEVC)는 이온 채널 2, 이온 펌프 3, 전송기 사를 포함하여 막 단백질의 다양한 이온 transport1의 메커니즘을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 최근 개발이 동시에 하나의 세포의 표면에 이러한 단백질의 특정 잔류물과 기능에 conformational 역학을 조사하기 위해 TEVC 함께 특정 사이트 형광단 라벨을 결합했습니다. 우리는 동시에 전압 클램프 fluorometry를 사용하여 형광 및 전류 변화를 모니터링하여 막 단백질의 conformational 역학을 공부하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 멤브레인 단백질 사이트 구체적으로 다음과 시스테인 교체 및 사이트 - 감독 형광단 라벨 5,6의 분자 운동을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 특정 잔류물 7,8 사이의 거리 제한을 결정하는 방법을 제공합니다. 이것은 선택적으로 관심의 두 변이 시스테인 잔류물에 기증자 및 수용체 fluorophores을 첨부하여 이루어진다. 간단히,이 실험은 Xenopus 교수의 oocytes의 표면에 원하는 단백질의 기능 표현 따라 수행됩니다. 이 oocytes의 큰 표면 영역은 손쉬운 기능 측정과 강력한 형광 신호가 5 수 있습니다. 그것은 쉽게 이러한 멤브레인 단백질 4의 메커니즘에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다 산도, 리간드 또는 양이온 / anions, 같은 세포외 약관을 변경할 수도 있습니다. 마지막으로, 최근의 개발은 또한 두 번째 단백질 9 공동 표현에 따라 선택 내부 이온의 조작을 활성화했습니다. 우리 프로토콜은 여러 부분에 설명되어 있습니다. 형광단 라벨이 transmembrane 및 세포외 도메인의 인터페이스에 위치하고 잔류물에 완료하여 첫째, 시스테인 돌연변이 유발 검사가 진행. 후속 실험은 단백질의 conformational 변화에 따라 형광 강도 (&lt;5 %) 3 큰 변화를 보여 잔류물을 식별하도록 설계되었습니다. 둘째, 형광 강도의 이러한 변화는 단백질 10의 기능에 conformational 역학을 상호 연관하기 위해 막 단백질의 운동 매개 변수에 비해 수 있습니다. 이것은 타겟 단백질의 분자 운동의 엄격한 biophysical 분석을 수 있습니다. 마지막으로, holoenzyme 두 잔류물은 기증자 photodestruction 방법을 사용하여 거리 제한을 결정하기 위해 기증자와 수용체의 형광단으로 표시 수 있습니다. 그것은 기증자와 수용체의 형광단와 라벨 다음과 같은 단백질 subunits의 상대 움직임을 모니터하는 것도 가능합니다.

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Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

연구

생물학

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

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