Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Экспериментальный подход, который мы описываем сочетает в себе конкретных участков маркировки флуорофора и два электрода напряжения зажим для изучения взаимосвязи между структурой и функцией мембранных белков. Эта техника может быть использована для получения временным разрешением информацию о конформационной динамики мембранных белков в транспорте ионов. Кроме того, этот подход может быть адаптирована для работы с различными белками, такими как ионные насосы, ионные каналы и транспортеры. В дополнение к исследованию конформационной динамики в определенный осадок, это также возможно использование флюоресценции резонансный перенос энергии для определения расстояния ограничений, в рамках холофермента. Определение расстояний между остатками, а также измерения относительного движения между подразделениями может помочь решить ключевые вопросы, связанные с литниковой механизмов.

<table border="1"><tbody><tr><th> Реагент / Оборудование </th><th> Компания </th><th> Реагент / Оборудование </th><th> Компания </th></tr><tr><td> 100 Вт источник света Вольфрам </td><td> Carl Zeiss Microimaging </td><td> флуоресцеин-5-малеимида </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Инструменты Всемирного Precision </td><td> Высокочистых ПЦР Добыча Kit </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3.0-4.0 Ethicon Викрил </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> 475AF40 фильтра возбуждения </td><td> Омега Оптические </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP дихроичных зеркал </td><td> Омега Оптические </td><td> Nucleospin плазмиды Kit </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Омега Оптические </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 фильтра возбуждения </td><td> Омега Оптические </td><td> PC-10 микропипетки Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP дихроичных зеркал </td><td> Омега Оптические </td><td> pCLAMP 10 программ </td><td> Axon инструменты </td></tr><tr><td> 565ALP выбросов фильтр </td><td> Омега Оптические </td><td> PfuTurbo ДНК-полимераза </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP выбросов фильтр </td><td> Омега Оптические </td><td> PIN-022A Фотодиод </td><td> Соединенные детектор Технологии </td></tr><tr><td> 570DRLP дихроичных зеркал </td><td> Омега Оптические </td><td> Поляризованные фильтры </td><td> Линос Phtonics ООО </td></tr><tr><td> Линос Phtonics ООО </td><td> Омега Оптические </td><td> QuickChange сайт-направленного Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Ревизора флуоресцентный микроскоп </td><td> Carl Zeiss MicroImaging GMBH </td><td> RC-10 флуоресцентный палаты </td><td> Warner инструменты </td></tr><tr><td> Warner инструменты </td><td> Life Technologies </td><td> tetramethylrhodamine-6-малеимида </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> DIGIDATA 1440A система сбора данных </td><td> Axon инструменты </td><td> ТОП10 Electrocompetent Клетки </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> ДПН я </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X усилителем </td><td> НПИ </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Два электрода напряжения зажим электрофизиологии (TEVC) является мощным инструментом для исследования механизма ионного transport1 для широкого спектра мембранных белков, включая ионные каналы 2, ионные насосы, 3, 4 и перевозчиков. Последние события в совокупности по конкретным участкам маркировки флуорофора вместе TEVC чтобы одновременно изучить конформационной динамики в определенных остатков и функции этих белков на поверхности одной клетки. Мы опишем метод изучения конформационной динамики мембранных белков одновременно флуоресценции и мониторинга текущих изменений с помощью напряжения зажим флуорометрии. Этот подход может быть использован для изучения молекулярного движения мембранных белков-сайт специально после замены цистеина и сайт-направленного флуорофора маркировки 5,6. Кроме того, этот метод обеспечивает подход для определения расстояния между определенными ограничениями остатков 7,8. Это достигается путем выборочного присоединения донора и акцептора флуорофоров до двух мутировал остатков цистеина интересов. Короче говоря, эти эксперименты выполняются следующие функциональные выражения нужный белок на поверхности ооцитов Xenopus Ливис. Большая площадь поверхности этих ооцитов позволяет поверхностных функциональных измерений и надежный сигнал флуоресценции 5. Кроме того, можно легко изменить внеклеточных условиях, таких как рН, лиганд или катионов / анионы, которые могут предоставить дополнительную информацию о механизме мембранные белки 4. Наконец, последние события также позволили манипуляции выборе внутренней ионов при одновременном выражение второго белка 9. Наш протокол описан в нескольких частей. Во-первых, цистеин сканирующий мутагенез предшествовать флуорофора маркировки завершено остатков расположена на стыке трансмембранного и внеклеточных доменов. Последующие эксперименты с целью выявления остатков, которые демонстрируют значительные изменения в интенсивности флуоресценции (&lt;5%) 3 на изменение конформации белка. Во-вторых, эти изменения в интенсивности флуоресценции сравниваются с кинетических параметров мембранного белка для того, чтобы соотнести конформационной динамики на функции белка 10. Это позволяет строгий биофизического анализа молекулярного движения целевого белка. Наконец, два остатка холофермента могут быть помечены с донором и акцептором флуорофора, чтобы определить расстояние ограничений с использованием методов доноров фотодеструкции. Кроме того, можно контролировать относительное движение белковых субъединиц следующие маркировки с донором и акцептором флуорофора.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Мы опишем метод, который измеряет кинетики ионного транспорта мембранных белков наряду с конкретным участкам анализ конформационных изменений с помощью флуоресценции от одиночных клеток. Эта техника адаптирована к ионные каналы, транспортеры и ионных насосов и может быть использована для определения расстояния между ограничениями белковых субъединиц.

Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Домашний сайт направленного мутагенеза Всего Плазмиды

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Экспертиза BCL-2 Семья функции с большим однослойные везикулы

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning дрожжи Сообщества для экспертизы флуоресценции Patterns

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...