Name: examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

<ol>
	<li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon:+Dynamic+Characteristic.">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+the+Na+/K+-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme.">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K++Channel+with+Fluorescence.">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating.">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li><li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters.">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li><li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+&#945;-+and+&#946;-Subunits+of+the+Na+/K+-ATPase.">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the &#945;- and &#946;-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li><li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na+,K+-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li><li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Na+/K+-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry.">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li><li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties.">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li><li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K++Channel+Complexes.">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+movement+by+the+Na/K+pump+in+Xenopus+oocytes.">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li><li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation.">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K++channel.">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li><li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li><li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlasMapper:+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps.">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li></ol>

Den experimentella tillvägagångssätt som vi beskriver kombinerar platsspecifika fluoroforen märkning och två elektroder spänning klämma för att undersöka sambandet mellan struktur och funktion hos membranproteiner. Denna teknik kan användas för att få tidsupplöst information om konformationsändringar dynamik membranproteiner under jontransport. Dessutom kan denna metod anpassas för att arbeta med olika proteiner som jonpumpar, jonkanaler och transportörer. Förutom att undersöka konformationsanalys dynamiken vid en specifik rester, är det också möjligt att använda fluorescens överföra resonans energi för att bestämma avståndet begränsningar inom en holoenzyme. Fastställandet av avstånden mellan rester samt att mäta den relativa rörelsen mellan subenheter kan hjälpa till att lösa viktiga frågor som rör gating mekanismer.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / utrustning </th><th> Företag </th><th> Reagens / utrustning </th><th> Företag </th></tr><tr><td> 100W Tungsten Ljuskälla </td><td> Carl Zeiss mikrovisualisering </td><td> fluorescein-5-maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> Hög-Pure PCR Extraction Kit </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 excitation filter </td><td> Omega Optisk </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroic spegel </td><td> Omega Optisk </td><td> Nucleospin Plasmid Kit </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optisk </td><td> Nanodrop 2000C Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 excitation filter </td><td> Omega Optisk </td><td> PC-10 Mikropipett Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroic spegel </td><td> Omega Optisk </td><td> pCLAMP 10 Programvara </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP utsläpp filter </td><td> Omega Optisk </td><td> PfuTurbo DNA-polymeras </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP utsläpp filter </td><td> Omega Optisk </td><td> PIN-022A Fotodiod </td><td> United Detector Technologies </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroic spegel </td><td> Omega Optisk </td><td> Polariserade filter </td><td> Linos Phtonics Inc. </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc. </td><td> Omega Optisk </td><td> QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner fluorescensmikroskop </td><td> Carl Zeiss mikrovisualisering GMBH </td><td> RC-10 Fluorescens avdelningen </td><td> Varnare Instrument </td></tr><tr><td> Varnare Instrument </td><td> Livet Technologies </td><td> tetramethylrhodamine-6-maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A datainsamlingssystem </td><td> Axon Instruments </td><td> Top10 Electrocompetent Celler </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> DPN jag </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X förstärkare </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling

Två elektrod spänning klämma elektrofysiologi (TEVC) är ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismen för jon transport1 för en mängd olika membranproteiner, inklusive jonkanaler 2, jonpumpar 3 och transportörer 4. Den senaste tidens utveckling har kombinerat platsspecifika fluoroforen märkning tillsammans TEVC att samtidigt granska konformationsanalys dynamiken på specifika rester och funktion av dessa proteiner på ytan av enskilda celler. Vi kommer att beskriva en metod för att studera konformationsändringar dynamik membranproteiner genom att samtidigt övervaka fluorescens och aktuella ändringar med hjälp av spänning-clamp fluorometri. Denna metod kan användas för att undersöka den molekylära rörelsen av membranproteiner plats-specifikt efter cystein byte och site-directed fluoroforen märkning 5,6. Dessutom ger denna metod en metod för att bestämma avståndet begränsningar mellan specifika rester 7,8. Detta uppnås genom att selektivt fästa givare och acceptor fluoroforer till två muterade cystein rester av intresse. I korthet är dessa experiment utförs följande funktionella uttryck av det önskade proteinet på ytan av Xenopus leavis oocyter. Den stora ytan av dessa äggceller gör lättvindigt funktionella mätningar och en robust fluorescenssignalen 5. Det är också möjligt att snabbt ändra den extracellulära förhållanden såsom pH, ligand eller katjoner / anjoner, som kan ge ytterligare information om mekanismen för membranproteiner 4. Slutligen har den senaste utvecklingen gjort det möjligt även manipulation av välja intern joner efter samtidig uttryck med en andra protein 9. Vår Protokollet beskrivs i flera delar. Först gick cystein skanning mutagenes genom fluoroforen märkning är avslutade rester ligger i gränssnittet för transmembrana och extracellulära domäner. Efterföljande experiment syftar till att identifiera rester som visar stora förändringar i fluorescensintensitet (&lt;5%) 3 på en conformationaländring av proteinet. För det andra är dessa förändringar i fluoroscensintensitet jämfört med den kinetiska parametrarna för membranprotein för att korrelera konformationsanalys dynamik till funktionen av proteinet 10. Detta möjliggör en noggrann biofysisk analys av molekylär rörelse målprotein. Slutligen kan två rester av holoenzyme märkas med en donator och acceptor fluoroforen för att bestämma avståndet begränsningar med hjälp av metoder donator photodestruction. Det är också möjligt att följa den relativa rörelsen av protein subenheter följande märkning med en donator och acceptor fluoroforen.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling at JoVE.com

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Vi kommer att beskriva en metod som mäter kinetik av jon transport av membranproteiner tillsammans platsspecifik analys av konformationsändringar använda fluorescens på enskilda celler. Denna teknik kan anpassas till jonkanaler, transportörer och pumpar jon och kan användas för att bestämma avståndet begränsningar mellan protein subenheter.

Undersöka Conformational Dynamics av ​​membranproteiner På plats Med Site riktad Fluorescens märkning

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Homemade Site Riktad mutagenes av Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Undersöka BCL-2 Familj Funktion med stora unilamellära vesiklar

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Cryosectioning Jäst gemenskapernas för att pröva Fluorescence mönster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvensspecifik Märkning av nukleinsyror och proteiner med metyltransferaser och kofaktor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Undersöka Conformational Dynamics av ​​membranproteiner På plats Med Site riktad Fluorescens märkning

Undersöka Conformational Dynamics av membranproteiner På plats Med Site riktad Fluorescens märkning