Name: analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM070736) لحاء Fölsch. كان مدعوما من قبل SF آنغ A STAR * الجائزة منحة دراسية عليا ، وكان مدعوما من قبل RS كانغ أساس الخلوية والجزيئية لبرنامج التدريب على الأمراض (GM8061)

1. عزل DNA البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الذيفان الداخلي خالية سيغما الدريخ maxiprep عدة للتحضير الحمض النووي الذيفان الداخلي مجانا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. هذه المجموعة تعمل من أجلنا ، لأنه يزيل السموم الداخلية من اي موثوق الا?...

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لتجربة microinjection الناجحة هي جودة ونقاء من الحمض النووي والتقاطب من الخلايا الخاصة بك. بدون خلايا الاستقطاب ، وسوف تسيطر بالفعل الخاص حقن وmistargeted VSVG ولا يمكن استخدامها لتكون التجربة. إذا كان الحمض النووي هو من نوعية رديئة ، قد دنا تسد إبرة ا?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Axiovert 200 مجهر مع مرحلة ساخنة </td><td> شركة كارل زايس </td><td> عرف النظام </td></tr><tr><td> Injectman micromanipulator NI2 Femtojet </td><td> إيبندورف </td><td> عرف النظام </td></tr><tr><td> Femtotips الثاني (الإبر Microinjection) </td><td> إيبندورف </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> نصائح Microloader </td><td> إيبندورف </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> 12 ملم واضحة transwell يدعم مرشح </td><td> كورنينج Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> الذيفان الداخلي خالية عدة maxiprep البلازميد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

الخلايا الظهارية استقطاب غشاء البلازما الخاصة بهم في كيميائيا ومتميزة وظيفيا المجالات قمية وbasolateral حيث المجال قمية يواجه &#39;الحرة&#39; السطوح والغشاء basolateral على اتصال مع الركيزة والخلايا المجاورة. ويفصل غشاء كلا المجالات التي منعطفات ضيقة ، والتي تشكل حاجزا نشرها. ويمكن تلخيصها قمية - basolateral بنجاح في ثقافة الاستقطاب عند المصنف الخلايا الظهارية مثل الكلى الناب مدين - داربي (MDCK) في الخلايا على مرشحات عالية الكثافة والبولي ومثقف لعدة أيام 1 2. وينظم إنشاء وصيانة قطبية الخلية من قبل مجموعة من GTPases صغير من الفصيلة مثل رأس رالا ، Cdc42 ، Rab8 ، وRab10 Rab13 3 4 5 6 7. مثل كل GTPases هذه البروتينات دورة الناتج المحلي الإجمالي بين دولة محددة نشط وفعال دولة GTP محدد. طفرات معينة في مناطق الربط النوكليوتيدات تتداخل مع هذه الدراجات 8. على سبيل المثال ، يتم تأمين دائم Rab13T22N في شكل الناتج المحلي الإجمالي ، وبالتالي يطلق عليها اسم &quot;المهيمن السلبية&quot; ، في حين لم تعد قادرة على Rab13Q67L يتحلل GTP ومؤمن وبالتالي في حالة &quot;نشطة المهيمنة&#39; 7. لتحليل وظيفتها في الخلايا عادة يتم التعبير عن كل من الأليلات السائدة السلبية والنشطة GTPases المهيمن على مستويات عالية للتدخل في وظيفة من البروتينات الذاتية 9. طريقة أنيقة لتحقيق مستويات عالية من overexpression في فترة قصيرة من الوقت هي لتعريف البلازميدات ترميز البروتينات ذات الصلة مباشرة في نوى خلايا الاستقطاب نمت على تصفية تدعم استخدام تقنية microinjection. غالبا ما يتم الجمع بين هذا مع الحقن المشترك للالبلازميدات مراسل تكود مستقبلات غشاء البلازما التي يتم فرزها على وجه التحديد إلى المجال أو قمية basolateral. وكثيرا ما تستخدم لشحن البضائع تحليل الفرز إلى المجال basolateral هو أليل درجة الحرارة حساسة من فيروس التهاب الفم الحويصلي بروتين سكري (VSVGts045) 10. لا يمكن لهذا البروتين بشكل صحيح في حظيرة 39 درجة مئوية ، وبالتالي فسيتم الاحتفاظ بها في شبكية هيولي باطني (ER) ، في حين يتم تجميع البروتين التنظيمية للمصلحة في العصارة الخلوية. التحول إلى 31 درجة مئوية وسوف يسمح لأمثال ثم VSVGts045 بشكل صحيح ، وترك لائحة والسفر إلى غشاء البلازما 11. عادة ما يتم تنفيذ هذه المطاردة في حضور سيكلوهيكسيميد لمنع المزيد من تخليق البروتين يؤدي إلى نتائج أكثر نظافة. نحن هنا تصف بالتفصيل إجراءات microinjecting البلازميدات الى خلايا الاستقطاب وحضانات التحولات اللاحقة بما في ذلك درجة الحرارة التي تسمح لتحليل شامل من البروتينات التنظيمية المشاركة في الفرز basolateral.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

هذه المقالة تفاصيل الإجراءات المتعلقة overexpression وتحليل GTPases صغيرة في الخلايا الظهارية الاستقطاب باستخدام تقنية microinjection.

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...