Name: analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (GM070736) naar H. Fölsch. SF Ang werd ondersteund door een A * STAR Graduate Scholarship Award, en RS Kang werd ondersteund door de cellulaire en moleculaire basis van Disease Training Program (GM8061)

1. Isolatie van plasmide-DNA <ol><li> Gebruik een Sigma-Aldrich endotoxine-vrij maxiprep kit om endotoxine vrij DNA voor te bereiden volgens de protocol van de fabrikant. Deze kit werkt voor ons, omdat het een betrouwbare manier verwijdert alle endotoxinen uit DNA-preparaten. Endotoxinen die met het DNA geïnjecteerd in celkernen zal leiden tot celdood. </li><li> Voeg 100 ul fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) om het geïsoleerde DNA, vortex en spin voor een min bij 13000 rpm in een Eppendorf microcentrifuge....

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

De belangrijkste stappen voor een succesvolle micro-injectie experiment zijn de kwaliteit en de zuiverheid van het DNA en de polariteit van je cellen. Zonder gepolariseerde cellen, zal de injectie controle al mistargeted VSVG en het experiment kan niet worden gebruikt. Als het DNA is van slechte kwaliteit, kan het DNA verstoppen de injectienaald die leidt tot slechte of geen expressie van het gewenste eiwit helemaal. Ook is het raadzaam om expressieplasmiden waarvan bekend is dat leiden tot hoge expressie niveaus, zoals...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscoop met verwarmd podium </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Custom order </td></tr><tr><td> Injectman NI2 Femtojet micromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> Custom order </td></tr><tr><td> Femtotips II (micro-injectie naalden) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader tips </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Heldere 12-mm transwell filter ondersteunt </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxine-free kit plasmide maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Epitheliale cellen polariseren hun plasmamembraan in biochemisch en functioneel verschillende apicale en basolaterale domeinen waar de apicale domeinnaam wordt geconfronteerd met de &#39;vrije&#39; oppervlakken en de basolaterale membraan is in contact met de ondergrond en de naburige cellen. Beide membraan domeinen zijn van elkaar gescheiden door tight junctions, die een diffusie barrière vormen. Apicale-basolaterale polarisatie met succes kunnen worden samengevat in de cultuur als epitheliale cellen zoals Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen worden gezaaid met een hoge dichtheid op polycarbonaat filters en gekweekt gedurende enkele dagen een twee. Opzetten en onderhouden van celpolariteit wordt geregeld door een reeks van kleine GTPases van de Ras superfamilie, zoals Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 en Rab13 3 4 5 6 7. Net als alle GTPases deze eiwitten cyclus tussen een inactieve GDP-gebonden toestand en een actieve GTP-gebonden toestand. Specifieke mutaties in de nucleotide binding regio&#39;s interfereren met deze fiets 8. Bijvoorbeeld, is Rab13T22N permanent opgesloten in het BBP-vorm en dus noemde &#39;dominant negatief&#39;, terwijl Rab13Q67L niet meer kan hydrolyseren GTP en is dus opgesloten in een staat &#39;dominante actief&#39; 7. Voor het analyseren van hun functie in de cellen zowel dominant negatief en dominant actieve allelen van GTPases zijn meestal uitgedrukt in hoge mate te bemoeien met de functie van de endogene eiwitten 9. Een elegante manier om een ​​hoog niveau van overexpressie in een korte tijd te bereiken is de invoering van de plasmiden die coderen voor de relevante eiwitten direct in de kernen van gepolariseerde cellen gekweekt op filter ondersteunt het gebruik van micro-injectie techniek. Dit wordt vaak gecombineerd met de co-injectie van de reporter-plasmiden die plasma membraan receptoren die specifiek zijn gesorteerd naar de apicale of basolaterale domeinnaam coderen. Een lading vaak gebruikt om lading te analyseren sorteren aan de basolaterale domein is een temperatuur gevoelig allel van de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVGts045) 10. Dit eiwit kan niet goed voudig bij 39 ° C en zal dus worden bewaard in het endoplasmatisch reticulum (ER), terwijl de regulerende eiwit van belang is gemonteerd in de cytosol. Een verschuiving naar 31 ° C zal dan de mogelijkheid VSVGts045 goed te vouwen, laat de ER en reizen naar de plasmamembraan 11. Dit jacht is meestal uitgevoerd in de aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese die leidt tot schoner resultaten te voorkomen. Hier beschrijven we in detail de procedure van microinjecting plasmiden in gepolariseerde cellen en de daaropvolgende incubaties inclusief temperatuur verschuivingen die een uitvoerige analyse van regulerende eiwitten die betrokken zijn bij basolaterale sorteren mogelijk te maken.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Dit artikel beschrijft de procedures met betrekking tot overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerd epitheliale cellen met behulp van micro-injectie techniek.

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generatie van transgene<em&gt; Hydra</em&gt; Door Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...