Name: analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM070736) zu H. Fölsch finanziert. SF Ang wurde von einem A * STAR Graduate Scholarship Award unterstützt, und RS Kang wurde von der Cellular and Molecular Basis of Disease Training Program (GM8061) unterstützt

1. Isolierung von Plasmid-DNA <ol><li> Verwenden Sie einen Sigma-Aldrich Endotoxin-freie Maxiprep Kit Endotoxin freie DNA nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Dieses Kit arbeitet für uns, denn es entfernt zuverlässig alle Endotoxinen aus DNA-Präparationen. Endotoxine, die mit der DNA in den Zellkern gespritzt wird zum Zelltod führen. </li><li> 100 l Phenol / chlorofom / Isoamylalkohol (25:24:1), um die isolierten DNA-, Vortex-und Spin für 1 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge. Über...

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	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Mikroinjektion Experiments sind die Qualität und Reinheit der DNA und die Polarität der Zellen. Ohne polarisierten Zellen, wird die Injektion Kontrolle bereits VSVG mistargeted haben und das Experiment kann nicht verwendet werden. Wenn die DNA ist von schlechter Qualität, kann die DNA verstopfen die Injektionsnadel, die zu schlechte oder gar keine Expression des gewünschten Proteins an alle. Auch ist es ratsam, Expressionsplasmide, die bekanntermaßen eine hohe Express...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Mikroskop mit Heiztisch </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Auftragsbezogene </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet Mikromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> Auftragsbezogene </td></tr><tr><td> Femtotips II (Mikroinjektion Nadeln) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader Tipps </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Klare 12-mm Transwell-Filter unterstützt </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxin-freie Plasmid Maxiprep kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Epithelzellen polarisieren ihrer Plasmamembran in biochemisch und funktionell unterschiedliche apikalen und basolateralen Bereichen, in denen die apikale Domäne Gesichter der &quot;freien&quot; Flächen und der basolateralen Membran in Kontakt mit dem Substrat und den benachbarten Zellen. Sowohl Membran-Domänen sind durch Tight Junctions, die eine Diffusionsbarriere Form getrennt. Apical-basolateralen Polarisation kann erfolgreich in Kultur rekapituliert werden, wenn Epithelzellen wie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen in hoher Dichte auf Polycarbonat-Filtern ausgesät und kultiviert für mehrere Tage 1 2. Aufbau und Pflege von Zellpolarität ist durch eine Reihe von kleinen GTPasen der Ras-Superfamilie wie Rala, Cdc42, Rab8, RAB10 und Rab13 3 4 5 6 7 geregelt. Wie alle GTPasen diese Proteine ​​Zyklus zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen Zustand und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. Spezifische Mutationen in der Nukleotid-bindenden Regionen stören mit diesem Rad 8. Zum Beispiel ist Rab13T22N dauerhaft in der GDP-Form gesperrt und damit Beinamen &quot;dominant negative&quot;, während Rab13Q67L nicht mehr hydrolysieren können GTP und ist somit in eine &quot;beherrschende active &#39;Zustand 7 gesperrt. Zur Analyse ihrer Funktion in Zellen sowohl dominant negative und dominant aktiven Allele GTPasen sind in der Regel auf einem hohen Niveau zum Ausdruck gebracht, mit der Funktion der körpereigenen Proteinen 9 eingreifen. Eine elegante Methode zur hohen Überexpression in kürzester Zeit zu erreichen, ist die Plasmide der entsprechenden Proteine ​​direkt in den Kernen der polarisierten Zellen auf Filterpapier unterstützt die Verwendung von Mikroinjektionstechnik gewachsen einzuführen. Dies ist oft mit dem Co-Injektion von Reporter-Plasmide, die Plasmamembran-Rezeptoren, die speziell auf die apikalen oder basolateralen Domäne sortiert kodieren kombiniert. Eine Ladung häufig verwendet, um Fracht zu analysieren Sortierung der basolateralen Domäne ist eine temperaturempfindliche Allel des vesikulären Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVGts045) 10. Dieses Protein kann nicht richtig falten bei 39 ° C und wird somit in das endoplasmatische Retikulum (ER) zurückgehalten werden, während das regulatorische Protein von Interesse im Cytosol zusammengebaut wird. Eine Verschiebung um 31 ° C lassen sich dann VSVGts045 richtig falten, verlassen das ER und Reisen in die Plasmamembran 11. Diese Jagd ist in der Regel in Gegenwart von Cycloheximid durchgeführt, um weitere Proteinsynthese, was zu saubereren Ergebnisse zu verhindern. Hier haben wir im Detail beschreiben das Verfahren der Mikroinjektion Plasmide in polarisierten Zellen und anschließender Inkubation wie Temperatur verschiebt sich, dass eine umfassende Analyse von regulatorischen Proteinen in basolateralen Sortierung beteiligt zu ermöglichen.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren in Überexpression und Analyse von kleinen GTPasen in polarisierten Epithelzellen mit Mikroinjektionstechnik beteiligt.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Forschung

Biologie

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...