Name: analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00
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Este trabajo fue financiado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang fue apoyado por una beca A * Star de Postgrado, y RS Kang recibió el apoyo de las bases celulares y moleculares de la enfermedad de Programa de Formación (GM8061)

1. Aislamiento de ADN plásmido <ol><li> Use un libre de endotoxinas Sigma-Aldrich kit maxiprep para preparar ADN endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este kit funciona para nosotros, ya que elimina las endotoxinas de forma fiable a partir de preparaciones de ADN. Endotoxinas que se les inyecta el ADN en los núcleos celulares se llevan a la muerte celular. </li><li> Añadir 100 ml de fenol / chlorofom / isoamilalcohol (25:24:1) para el ADN aislado, vórtice y vuelta durante 1 minuto a 13.000 rpm en...

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Los pasos más importantes para un experimento de microinyección éxito son la calidad y pureza del ADN y la polaridad de las células. Sin células polarizadas, el control de la inyección ya se han mistargeted VSVG y el experimento no se puede utilizar. Si el ADN es de mala calidad, el ADN puede obstruir la aguja de inyección que lleva a los pobres o no la expresión de la proteína deseada en absoluto. Además, es aconsejable usar plásmidos de expresión que se sabe que conducen a altos niveles de expresión como ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscopio con la etapa calienta </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> La orden de encargo </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipulador </td><td> Eppendorf </td><td> La orden de encargo </td></tr><tr><td> Femtotips II (agujas de microinyección) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader consejos </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Claro de 12 mm Transwell filtro admite </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxinas libres para el plásmido maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Las células epiteliales polarizar su membrana plasmática en los dominios apical y basolateral de vista bioquímico y funcionalmente diferentes, donde el dominio apical se enfrenta a la &#39;libre&#39; y las superficies de la membrana basolateral está en contacto con el sustrato y las células vecinas. Ambos dominios de la membrana están separados por uniones estrechas, que forman una barrera de difusión. Apical-basolateral polarización se pueden recapitular con éxito en el cultivo cuando las células epiteliales como el riñón canino Madin-Darby (MDCK) se siembran a alta densidad en los filtros de policarbonato y se cultivan durante varios días 1 2. Establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular está regulado por una serie de pequeñas GTPasas de la superfamilia Ras como Rala, Cdc42, Tab8, Rab10 y Rab13 3 4 5 6 7. Al igual que todas las GTPasas estas proteínas del ciclo entre una inactivos PIB determinada del Estado y un Estado activo GTP. Mutaciones específicas en las regiones de unión de nucleótidos interferir con este ciclo de 8. Por ejemplo, Rab13T22N está permanentemente encerrado en el PIB de forma y por lo tanto llamado &quot;dominante negativo&quot;, mientras que Rab13Q67L ya no pueden hidrolizar GTP y por lo tanto encerrado en una &quot;dominante activo&quot; del Estado 7. Para analizar su función en las células de los dos alelos dominantes negativos activa y dominante de GTPasas se suelen expresar en niveles altos para interferir con la función de las proteínas endógenas 9. Una manera elegante de alcanzar altos niveles de sobre-expresión en un corto período de tiempo es la introducción de los plásmidos que codifican las proteínas relevantes directamente en los núcleos de las células polarizadas crecido en el filtro admite el uso de la técnica de microinyección. Esto se combina a menudo con la co-inyección de reportero plásmidos que codifican los receptores de la membrana plasmática que están específicamente ordenados en el dominio apical o basolateral. Una carga usados ​​para analizar la carga de clasificación para el dominio basolateral es un alelo sensible a la temperatura de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína no se pueden plegar correctamente a 39 ° C y por lo tanto se mantendrá en el retículo endoplasmático (ER), mientras que la proteína reguladora de interés se monta en el citosol. Un cambio a 31 ° C, entonces permitirá que VSVGts045 a veces bien, salir de la sala de emergencia y los viajes a la membrana plasmática 11. Esta persecución se realiza generalmente en presencia de cicloheximida para prevenir la síntesis de proteínas mayor que conduce a resultados más limpios. A continuación se describe en detalle el procedimiento de la microinyección de plásmidos en células polarizadas y incubaciones posteriores incluyendo los cambios de temperatura que permiten un análisis completo de las proteínas reguladoras implicadas en la clasificación basolateral.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Este artículo detalla los procedimientos involucrados en la sobreexpresión y el análisis de las pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

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Investigación

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Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

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Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

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The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...